一种基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法与流程

本发明涉及一种基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，属于农产品安全检测技术领域。

背景技术：

抗生素是一种能抑制或杀死其他微生物细胞的生理活性物质，主要由微生物产生。自20世纪30年代发现青霉素以来，现如今已被发现的抗生素有2000多种。常在奶牛中使用的抗生素主要有氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类和大环内酯类等。 如果人类长期食用含抗生素残留的动物性食品后，药物不断在体内蓄积，会对人体产生毒性作用，增加细菌的耐药性，引起人体的过敏和变态反应，甚至会产生致癌、致畸、致突变作用。虽然近年来国际上严格限制抗生素的残留最大量，但由于其对某些作物具有生长刺激作用，所以仍有不少违章使用现象，因此实现对抗生素的检测是至关重要的。

普通的三电极系统不便于携带，传统电极上生物识别过程引起的阻抗变化非常小，其电极表面的半无限线性扩散层易使反应物损耗；微阵列电极虽然可以将反应过程中发生的阻抗变化放大，但其易被磨损，造成再次利用时的偏差。相比传统电极，丝网印刷电极轻巧，携带方便，可一次性使用，对于现场检测具有很好的优势，因此丝网印刷电极与传统的检测系统相结合成为具有潜力的选择。传统的农药残留检测方法具有选择性好、灵敏度高和准确度高，同时检测多种元素或化合物的优势，但其需要昂贵的仪器设备,样品的前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于现场快速检测。因此本文尝试制备一种基于两种探针的检测抗生素残留的比率型适配体传感器。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能克服上述方法的缺陷，且灵敏度高、特异性高、集成化、便携化的抗生素素残留检测的比率型适配体传感器检测方法。采用的技术方案为：利用丝网印刷电极的集成化、便携化，利用二茂铁,即Fc、纳米碳纤维即NCFs两种探针分别构建相应的适配体传感器，在两种基础传感器的基础上构建比率型传感器，以达到灵敏度高、精确度高、减小批次间差异的检测目的。通过抗原与适配体间的特异性反应，检测电极表面的电流值变化，研究该传感器的电化学性能。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法的步骤如下 ：

1）纳米金/纳米金-壳聚糖复合物、纳米碳纤维、二茂铁-适配体的制备；

2）清洗活化丝网印刷电极，得到预处理的丝网印刷电极；

3）将步骤1）制备得到的纳米金-壳聚糖复合物和纳米碳纤维/纳米金分别修饰到步骤2）预处理的丝网印刷电极上，得到修饰好的丝网印刷电极；

4) 将二茂铁-适配体、适配体分别滴加到步骤3）所得的修饰好的丝网印刷电极上，自然晾干后得到基于丝网印刷电极的基础适配体传感器；

5）优化步骤4）所得的基础适配体传感器的三种试验条件；

6）在步骤5）所得的最优条件下，对四环素等抗生素进行检测。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤1）所述纳米金-壳聚糖复合物、纳米碳纤维、二茂铁-适配体分别是以壳聚糖为分散剂分散纳米金，取一定浓度的纳米碳纤维溶液，将二茂铁与适配体混合得到分散均匀的悬浊液。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤3）所述丝网印刷电极电极的修饰，是分别先将7 μL纳米金-壳聚糖复合物、30% 纳米碳纤维溶液和纳米金溶液滴加到预处理的丝网印刷电极上，室温下晾干，分别得到纳米金-壳聚糖，纳米碳纤维/纳米金修饰的丝网印刷电极。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤4）所述在修饰好的电极上分别滴加7 μL 二茂铁-适配体复合物、适配体溶液，是将7 μL 二茂铁-适配体复合物滴加到纳米金-壳聚糖修饰好的丝网印刷电极上，将7 μL 适配体溶液滴加到纳米碳纤维/纳米金修饰的丝网印刷电极上，在4℃条件下干燥，得到两种适配体生物传感器。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤5）所述两种适配体生物传感器的三种试验条件测试底液pH值、适配体浓度、孵育时间分别进行了优化：pH值为7.0，适配体浓度为6 μM，孵育时间为60 min。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤6）所述滴加不同浓度的四环素标准液，孵育 60 min，在底液中进行循环伏安法检测。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1） 纳米金/纳米金-壳聚糖复合物、纳米碳纤维、二茂铁-适配体的制备：100 mL 质量体积比为0.01%的氯金酸滴加到烧杯中，置于电炉上加热，边加热边搅拌直至沸腾，然后迅速加入2.5 mL 1%柠檬酸钠溶液，随着反应的进行该溶液很快变成了红宝石颜色，说明指示的金纳米粒子的形成；剧烈搅拌该溶液持续1小时后，得到所制备的纳米金溶液；称取0.5 g壳聚糖置于烧杯中，加入1.0 %的醋酸溶液搅拌溶解，将溶解好的溶液置于250 mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入烧杯中，在磁力搅拌器下磁力搅拌10 h，得到0.2%的壳聚糖溶液；将20 mL 1％的壳聚糖乙酸溶液搅拌加入到上述纳米金溶液中得到纳米金-壳聚糖复合物；1 g二茂铁加入到100 mL 乙醇溶液中超声30 min，得到 1%二茂铁溶液，然后将适配体溶液加入到二茂铁溶液中，在4 ℃下搅拌混匀12小时，得到二茂铁-适配体复合物；

2）丝网印刷电极的清洗、活化：首先，将丝网印刷碳电极放入盛有1mM 氢氧化钠溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干，然后，将电极放入盛有1mM 盐酸溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干，之后用无水乙醇清洗电极，氮气吹干，最后，在pH 5.0的磷酸盐缓冲液中进行电流-时间曲线扫描300s，之后，进行循环伏安曲线扫描，直至性能稳定；

3）丝网印刷电极的修饰：在丝网印刷电极上分别滴加7 μL 纳米金-壳聚糖复合物、30% 纳米碳纤维溶液和纳米金溶液滴加到预处理的丝网印刷电极上，室温下晾干，分别得到纳米金-壳聚糖，纳米碳纤维/纳米金修饰的丝网印刷电极；

4）适配体的固定：在上述的电极上滴加7 μL二茂铁-适配体复合物滴加到纳米金-壳聚糖修饰好的丝网印刷电极上，将7 μL 适配体溶液滴加到纳米碳纤维/纳米金修饰的丝网印刷电极上，在室温下干燥，得到两种适配体生物传感器，并将制备好的电极放于4 ℃干燥的环境中保存备用；

5）试验条件的优化：制备一系列pH值的磷酸盐缓冲液，pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并分别配成了一系列的检测底液，在这些底液中对传感器电流值进行检测，筛选出最佳pH值7.0；分别向电极负载2 μM、4 μM、5 μM、6 μM、8 μM的适配体，对其电流值进行检测，筛选出最佳适配体浓度为6 μM；用同一浓度的四环素孵育时间分别控制为30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，对其电流值进行检测，筛选出最佳孵育时间为60 min；

6）四环素的检测：在最优条件下：pH 7.0，适配体浓度 6 μM，孵育时间60 min，在两种适配体传感器上对不同浓度的四环素进行电流检测，并分别建立了建立不同四环素浓度与丝网印刷电极电流变化之间的关系曲线，进而得到不同浓度的四环素的对数值与电流峰值比率之间的线性回归方程，在浓度范围10^-11～10^-9g/mL内得到y=-0.02854x - 0.02655，相关系数为 0.994；在浓度范围10^-9～10^-3g/mL内得到y = -0.00225x + 0.20538，相关系数0.997。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，牛奶中四环素等抗生素残留具体检测步骤如下：

1）牛奶样品的前处理：在当地超市购买牛奶，把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后分装到离心管中，以20000转/秒的速度离心90min；离心结束后，牛奶分为明显的三层，上、下层是脂肪和酪蛋白等大分子物质，为了避免大分子物质对抗生素的包裹，我们去中间一层的乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四环素等抗生素，浓度分别是5×10^-10 g/mL，5×10^-9g/mL，5×10^-8g/mL，5×10^-7g/mL；

2）样品的检测：在最优条件下：pH 7.0，适配体浓度 6μM ，孵育时间60 min，对牛奶样品进行检测；

3）根据建立的相应的线性关系，计算出相应样品的四环素等抗生素残留量。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，用于检测四环素等抗生素残留。

所述基于丝网印刷电极检测抗生素残留的比率型适配体传感器的制备方法，其特征在于，所用电极为丝网印刷电极，包括一印制电极的基片、基片上印制的外部绝缘层和三根电极引线，其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，一个工作电极：碳电极；一个对电极：碳电极，直径3mm；和一个参比电极：Ag/AgCl电极，各电极对应连接有一电极引线，该电极电化学性能稳定，均一性好,后面的说明中，该丝网印刷电极简写为SPCE。

所述方法，其特征在于，采用本发明制备的基于丝网印刷电极的比率型适配体检测四环素的传感器具有操作简单、成本低廉、检测灵敏度高、精确度高、减小批次间差异等优点且反应时间短，样品和试剂消耗量少，稳定性高，可用于实际样品的现场检测，符合我国四环素残留快速检测技术发展和国际化要求。

附图说明

图1 二茂铁-适配体、纳米碳纤维即NCFs、纳米碳纤维-纳米金即NCFs-AuNPs复合物的扫描电镜图：A.低倍率下二茂铁-适配体复合物的扫描电镜图；B.高倍率下二茂铁-适配体复合物的扫描电镜图；C. 纳米碳纤维的扫描电镜图；D. 纳米碳纤维-纳米金的扫描电镜图；

图2 纳米金-壳聚糖/二茂铁-适配体/牛血清白蛋白/四环素传感器组装过程中含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的铁氰化钾的磷酸盐缓冲液中的循环伏安表征图：a）空丝网印刷电极即SPCE；b）纳米金-壳聚糖/SPCE；c) 二茂铁-适配体/纳米金-壳聚糖/SPCE；d）牛血清白蛋白/二茂铁-适配体/纳米金-壳聚糖/SPCE；e）四环素/牛血清白蛋白/二茂铁-适配体/纳米金-壳聚糖/SPCE；

图3 纳米碳纤维/纳米金/适配体/牛血清白蛋白/四环素传感器组装过程中含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的铁氰化钾的磷酸盐缓冲液中的循环伏安表征图：a）空丝网印刷电极；b）纳米碳纤维/SPCE；c) 纳米金/纳米碳纤维/SPCE；d）适配体/纳米金/纳米碳纤/SPCE；e）血清白蛋白/适配体/纳米金/纳米碳纤维/SPCE；f）四环素/牛血清白蛋白/纳米金/纳米碳纤维/SPCE；

图4 底液pH值对传感器电流响应的影响；

图5 适配体浓度对传感器电流响应的影响；

图6 孵化时间对传感器电流响应的影响；

图7 纳米金-壳聚糖/二茂铁-适配体/牛血清白蛋白/四环素传感器被不同浓度四环素孵育后的差分脉冲伏安曲线，四环素浓度：a-k: a. 0g/mL； b. 10-3g/mL；c.10-4g/mL；d.10-5g/mL；e.10-6g/mL；f.10-7g/mL；g.10-8g/mL；h.10-9g/mL；i.10-10g/mL；j. 10-11g/mL；k. 10-12g/mL；

图8 纳米碳纤维/纳米金/适配体/牛血清白蛋白/四环素传感器被不同浓度四环素孵育后的差分脉冲伏安曲线，四环素浓度：a-j: a.0g/mL；b.10-3g/mL；c.10-4g/mL； d.10-5g/mL；e.10-6g/mL；f.10-7g/mL；g.10-8g/mL；h.10-9g/mL；i.10-10g/mL；j. 10-11g/mL；

图9 两种传感器分别孵育四环素后的电流变化与四环素浓度的对数的线性关系；

图10 两种传感器分别孵育四环素后的电流变化比率与四环素浓度的对数的线性关系；

图11 该比率型适配体传感器对实际样品中抗生素加标回收率的检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例 1 一种基于丝网印刷电极比率型适配体传感器的制备步骤 ：

1） 纳米金/纳米金-壳聚糖复合物、纳米碳纤维、二茂铁-适配体的制备：100 mL 0.01%的氯金酸滴加到烧杯中，置于电炉上加热，边加热边搅拌直至沸腾，然后迅速加入2.5 mL 1% 柠檬酸钠溶液，随着反应的进行该溶液很快变成了红宝石颜色，说明指示的金纳米粒子的形成；剧烈搅拌该溶液持续1小时后，得到所制备的纳米金溶液；称取0.5 g壳聚糖即CS置于烧杯中，加入1.0 %的醋酸溶液搅拌溶解，将溶解好的溶液置于250 mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入烧杯中，在磁力搅拌器下磁力搅拌10 h，得到0.2%的壳聚糖溶液；将20 mL 1％的壳聚糖乙酸溶液搅拌加入到上述纳米金溶液中得到纳米金-壳聚糖复合物；1 g二茂铁加入到100 mL乙醇溶液中超声30 min，得到 1%二茂铁溶液，然后将适配体溶液加入到二茂铁溶液中，在4 ℃ 下搅拌混匀12小时，得到二茂铁-适配体复合物；

2）丝网印刷电极的清洗、活化：首先，将丝网印刷碳电极放入盛有1mM NaOH溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干，然后，将电极放入盛有1mM HCl 溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干，之后，用无水乙醇清洗电极，氮气吹干，最后，在pH 5.0的磷酸盐缓冲液中进行电流-时间曲线扫描300s，之后进行循环伏安曲线扫描，直至性能稳定；

3）丝网印刷电极的修饰：在丝网印刷电极上分别滴加7 μL 纳米金-壳聚糖复合物、30% 纳米碳纤维溶液和纳米金溶液滴加到预处理的丝网印刷电极上，室温下晾干，分别得到纳米金-壳聚糖，纳米碳纤维/纳米金修饰的丝网印刷电极；

4）适配体的固定：在上述的电极上滴加7 μL 二茂铁-适配体复合物滴加到纳米金-壳聚糖修饰好的丝网印刷电极上，将7 μL 适配体溶液滴加到纳米碳纤维/纳米金修饰的丝网印刷电极上，在室温下干燥，得到两种适配体生物传感器，并将制备好的电极放于4 ℃干燥的环境中保存备用。

实施例 2 适配体生物传感器组装过程中的电化学表征

1）运用扫描电子显微镜对修饰有二茂铁-适配体、纳米碳纤维、纳米碳纤维-纳米金的丝网印刷电极的微观结构图进行表征，如图1所示，可以看到纳米材料成功修饰到电极表面；

2）纳米金-壳聚糖/二茂铁-适配体/牛血清白蛋白/四环素组装过程中不同电极在含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的铁氰化钾的磷酸盐缓冲液中的循环伏安曲线，如图2所示，图中曲线a）是空丝网印刷电极的表征图，我们可以看出明显的氧化还原峰；如图中曲线b）所示，当丝网印刷电极上修饰上纳米金-壳聚糖纳米材料后，由于纳米金具有良好的导电性，因此电流比空丝网印刷电极有所增大；如曲线c）所示，在此基础上又修饰了二茂铁-适配体后，因为二茂铁也具有导电性，所以电流再次增大；当固定牛血清白蛋白7 μL后，由于其是大分子蛋白质，它不但不导电，而且还会阻碍界面的电子传递，所以电流峰值变小，如曲线d）所示；

3）纳米碳纤维/纳米金/适配体/牛血清白蛋白/四环素组装过程中不同电极在含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的铁氰化钾的磷酸盐缓冲液中的循环伏安曲线，如图2所示，图中曲线a）是空丝网印刷电极的表征图，我们可以看出明显的氧化还原峰；如图中曲线b）所示，当丝网印刷电极上修饰上纳米碳纤维纳米材料后，由于纳米碳纤维具有良好的导电性，因此电流比空丝网印刷电极有所增大；如曲线c）所示，在此基础上又修饰了纳米金后电流再次增大；当固定适配体7 μL后，由于适配体是蛋白质分子，它不但不导电，而且还会阻碍界面的电子传递，所以电流峰值变小，如曲线d）所示，这也证明了适配体已经成功的固定到电极表面。

实施例3 试验条件的优化

1）pH值的优化

测试底液pH值的不同，对适配体的活性有不同的影响，进而会影响传感器的灵敏度，所以，本实验制备了一系列pH值的磷酸盐缓冲液，pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并分别配成了一系列的检测底液；图4显示的是两种传感器在不同pH值底液中适配体与四环素孵育前后进行的循环伏安法测定的电流差值的大小。从图中可以看出，当pH值为7.0时，差值最大，这表明，pH 7.0是该传感器的最优pH值，此时，适配体能够更好地发挥活性；

2）适配体浓度的优化

为了减少实验中适配体的浪费，让适配体传感器的性能更加优越，对适配体传感器的一些实验条件进行了优化，将修饰好的电极浸入到不同浓度的适配体溶液中，让适配体固定到电极上，然后用制备好传感器对相同浓度的四环素进行检测，使用差分脉冲伏安的方法测量峰电流的变化。从图5中可以明显的看出，ΔI的值随着适配体浓度的增大不断地增大。当浓度大于6 μM后，ΔI的值基本保持在稳定的状态。这个现象表明，本实验中适配体的浓度取6 μM已经足够覆盖电极的表面，适配体与四环素的特异性结合达到饱和。因此，6 μM的适配体为最佳的浓度；

3）孵化时间的优化

孵育时间是衡量传感器性能的一个重要的标准，为了确定最佳的孵育时间，将制备好的适配体传感器都滴加相同浓度的四环素，让其反应不同的时间，并测量不同时间下的ΔI值的变化，如图6所示，ΔI的值随着时间的增加不断地增大，然而，时间大于60 min后ΔI的值不再随时间变化而变化，而是保持在一个稳定的水平，这主要是固定到电极上的适配体捕捉的四环素已经到达了饱和，所以，最佳的孵育时间选择60 min。

实施例4 所制备的比率型适配体传感器的应用

1）孵育四环素后的电流变化比率与四环素浓度的对数的线性关系

配置一系列浓度的四环素标准溶液，在两种适配体传感器上对不同浓度的四环素进行差分脉冲伏安扫描即图7、图8，并分别建立了建立不同四环素浓度与丝网印刷电极电流变化之间的关系曲线即图9，进而得到不同浓度的四环素的对数值与电流变化比率即△I_CNFs/△I_Fc之间的线性回归方程：在浓度范围10^-11～10^-9g/mL内得到y=-0.02854x - 0.02655，相关系数为 0.994；在浓度范围10^-9～10^-3g/mL内得到y = -0.00225x + 0.20538，相关系数0.997，即图10；

2）检测实际样品牛奶中的抗生素残留

在当地超市购买牛奶，把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后分装到离心管中，以20000转/秒的速度离心90min。离心结束后，牛奶分为明显的三层，上、下层是脂肪和酪蛋白等大分子物质，为了避免大分子物质对四环素的包裹，我们去中间一层的乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四环素，浓度分别是5×10^-10 g/mL，5×10^-9g/mL，5×10^-8g/mL，5×10^-7g/mL；在最优条件下对牛奶样品进行检测，加标样品中四环素的浓度根据校正曲线算出，其回收率可以达到95.98%-104.28%，如图11所示。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。