一种细胞病理切片快速染色检测方法与流程

本发明涉及生物细胞、组织染色技术领域及细胞学定性和DNA定量检测分析方法，具体是切片经过特殊染色后，同时进行定性和定量检测。

背景技术：

细胞病理作为现代病理学分支部分，因其取材方便、相对无创，检测快速且经济实用，越来越受到关注。传统的细胞检测方法是指检测者在显微镜下通过观察细胞形态特征的变化，从而判断细胞是否发生病变。为了对细胞有效观察，在检测之前通常需要对细胞进行染色，常用的染色方法有苏木素伊红染色法、巴氏染色法、邵氏染色法等。这些方法多依据不同细胞器的酸碱性不同，从而结合不同颜色的染料，以便在显微镜下区分细胞膜、细胞浆以及细胞核以及细胞其他结构的一些变化。这种形态学分析只能为观察者呈现出一些细胞特征（如细胞核大小、核浆比或者细胞核颗粒存在情况等）。由于个体的差异性，导致细胞形态复杂多变，能否准确判断和解读形态变化究竟是否真正的病变，主要取决于细胞学医生的经验和资质,因此，检测结果主观性较强可重复性不好。由于肉眼辨识度的限制，也很难区分交界性病变的性质，或是无法发现一些形态学变化不典型的病变，会不可避免造成一定数量漏诊的病例。

染色体是一部完整的生命百科全书，每个物种都有一套独特的染色体（即染色体组），对于物种的存在，染色体具有决定性作用。同时，精细的有丝分裂机制，也保证了染色体在细胞传代过程中，数量和结构始终保持稳定。但致癌物质、罕见的遗传病症以及偶发的有丝分裂错误可能使这种稳定状态遭到破坏。19世纪末20世纪初，David von Hansemann和Theodor Boveri Von Hansemann发现所有癌细胞都含有异常染色体。随着检测技术的进步，越来越多数据表明：癌细胞以及正在癌变的也就是病变细胞都会违背“染色体组稳定”这一自然法则，通过产生数量异常染色体的细胞引发肿瘤。染色体的异常数量使得数以千计的基因和它们编码的蛋白质处于失衡状态，从而使细胞产生恶性表型，也为细胞发展成为更严重的染色体异常细胞创造了条件。癌细胞染色体数目异常程度越高，染色体变异速度越快,因此可通过对细胞核内染色体数目或DNA含量的变化测定来判断细胞的病变情况,这属于定量检测。先通过DNA特异性染色，对细胞DNA进行标记，由于染色为化学反应，可在标记物多少和DNA含量之间建立线性关系，通过检测标记物的多少，判断DNA含量大小。这种方法能在病变早期发现遗传物质的变化，敏感性好；检测由设备进行，与操作人员的经验或资质无关，避免了主观因素造成的误差，结果可重复性好。但这种检测中使用的染色方法造成检测时只能看到细胞核，在缺乏细胞浆的情况下，无法判断病变细胞类型。此外，在复核细胞核时，也会因为没有细胞浆，但凭借染色的核很难区分是标本中的杂质还是真正的细胞核，如果将杂质误判为诊断细胞，也会造成误诊。DNA测量的图像分析对多个细胞核重叠即成团核的分割是难点，通常直接跳过这类细胞，不识别，这会导致漏诊。

因此，细胞形态学定性分析的方法染色时间短，流程简单，但不稳定，对技术员要求高，诊断只基于细胞的形态学特征，依赖细胞学家的经验和技巧，误诊率非常高；DNA定量分析方法基于DNA特异的染色方法，染色时间长，染色条件要求高，试剂不稳定。DNA测量依赖于细胞核的特征，对单个细胞核能很好的分割测量，对于多个细胞核重叠即成团核的分割测量是DNA定量分析的难点，通常直接跳过这类细胞，不识别，且不能提供任何关于细胞形态学方面的信息。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种细胞病理切片快速染色检测方法，使染色时间短，流程简单，染色后切片可同时进行细胞形态学分析和细胞核DNA定量检测，提高病变细胞检测的准确度。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种细胞病理切片快速染色检测方法，包括以下步骤：

第1步：对切片进行染色处理，使细胞核和细胞质均染上颜色，并且两者所染颜色对比明显，保证在捕捉到的图像中，细胞核和细胞质都能清晰呈现；

第2步：通过检测软件转换通道及非线性校准，过滤细胞质颜色，准确测量细胞核DNA含量，同时采用高分辨率显微镜及数码彩色摄像头采集采集每个细胞核相应的细胞形态学图片及合成完整数字切片；

第3步：根据单个及成团细胞核DNA含量变化结合细胞形态学的变化判断病变细胞。

上述第1步中染色处理包括：

步骤a：将制好的标本自然干燥；

步骤b：将干燥的切片置预处理液中固定10-30分钟，然后流水洗涤4-5次；

步骤c：经过步骤b处理的标本放入50～55℃的盐酸液中酸化5-10分钟，然后流水洗涤4-5次；

步骤d：经过步骤c酸化的标本放入50～55℃的特殊染色液A中染色5-15分钟，然后流水洗涤4-5次；

步骤e：经过步骤d染色的标本用蒸馏水浸洗5分钟；

步骤f：经过步骤d浸洗的标本依次放入50%酒精内脱水2分钟，75%酒精内脱水2分钟，95%酒精内脱水3分钟；

步骤g：经过步骤f逐级脱水后的标本置于特殊染色液B中染色1-5分钟；

步骤h：经过步骤g染色的标本在无水乙醇浸泡两次，每次3分钟；

步骤i：经过步骤h的标本用树胶盖片封固。

上述染色处理中使用的试剂包括预处理液、盐酸液、特殊染色液A和特殊染色液B，其中：

所述预处理液采用AF液、4%多聚甲醛、10%中性甲醛、95%乙醇、BS液中的任意一种或一种以上；

所述盐酸液按质量百分比包含35%～45%浓盐酸、55%～65%蒸馏水；

所述特殊染色液A按质量百分比包含0.10%～1%吩噻嗪类染料、1.8%～2.2%盐酸液、0.09%～0.12%偏重亚硫酸钠、剩余质量百分比由蒸馏水补足，所述吩噻嗪类染料由次甲基蓝、天青A、硫堇中的一种或一种以上组成；

所述的特殊染色液B按质量百分比包含0.005%～0.1%酸性染料、75%～96%醇类试剂、剩余质量百分比由蒸馏水补足，所述酸性染料由伊红、油红O、丽春红2R、比布列西猩红中的一种或一种以上组成，醇类试剂由乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇中的一种或一种以上组成。

上述描述的各个试剂个组分的体积和质量指数提供一种比例关系，并不表示本发明中各个试剂只能用上述的体积和质量。

优选的，上述步骤中的最佳的处理时间为：步骤b固定15分钟，步骤c酸化7分钟，步骤d染色10分钟，步骤f染色3分钟。

第2步中检测软件上将原始绿通道转换为红通道，过滤细胞质颜色；非线性校正过程包括调整光源亮度、图像曝光值、图像灰度偏移值、图像分割阈值补偿参数、贝尔模式（Bayer）模型解析参数、指数模型变换等参数，从而准确测量细胞核DNA含量。

非线性校正的过程具体如下：

步骤（1）：设置一组指数模型变换调节参数、贝尔模式（Bayer）解析调节参数和图像分割阈值补偿参数；

步骤（2）：按常规显微镜调节方式调节DNA检测设备照明、视场光阑、孔径光阑，调节曝光时间在指定的范围区间，图像直方图展示图像亮暗状态在非饱和范围；

步骤（3）：放置一标准切片并设置一个扫描区域，扫描完成后，检查标准切片的IOD（积分光密度）、二倍体细胞标准方差CV，以确定DNA检测设备分辨率是否正常，计算四倍体IOD与二倍体IOD的比值是否符线性关系。将以上参数和质控系统的扫描参数对比，以质控设备为标准，调节指数模型变换参数和Bayer解析参数；

步骤（4）：重复上述步骤（1）-（3），直到同一张标准切片的扫描参数指标IOD（积分光密度）、二倍体细胞标准方差CV以及四倍体IOD与二倍体IOD的线性关系,在DNA检测设备与在标准质控系统扫描得到的参数其差值在允许误差范围内，校正完成。

第2步中数码彩色摄像头采集细胞形态图是在高分辨率显微镜设置为20倍下拍摄，检测人员无需镜下阅片，可根据DNA含量提示，阅读部分图片即可做出诊断，节约阅片人员时间，提高诊断效率。

第3步中的具体步骤包括：

I：选取同一切片上的正常细胞做内参细胞，并通过检测软件将所有细胞核按照DNA含量由大到小的顺序排列；

II：DNA含量定量分析时，可观察到相应细胞核的全细胞形态，判断是否为真正的细胞核以及核浆比、形态变化，并对细胞类型作出判断；

III：细胞形态学判读时，检测软件按细胞核DNA含量由大到小排列相应的细胞形态图片，根据DNA含量提示，阅读部分图片即可做出诊断；

Ⅳ：检测软件将多个细胞核重叠即成团核图像分割并且计算这些成团核的DNA含量，再通过细胞学定性分析；

Ⅴ：根据II、III、Ⅳ步骤的综合分析，判断被检测细胞为正常或非正常。

本发明由于采用了特殊的染色方法，细胞核和细胞质能在短时间内呈现清晰颜色，流程简单，效率高，应用范围广，为术中冰冻切片诊断提供可能；通过检测软件转换通道及非线性校准，过滤细胞浆颜色，准确测量细胞核DNA含量；在DNA测量时不仅将切片中所有单个独立细胞核精确测量，且将成团细胞核测量并记录，通过细胞学定性，提高诊断敏感性和特异性；在DNA测量的同时采集每个细胞核相应的细胞形态学图片及整个数字切片扫描，可数字切片传输，远程会诊等。

附图说明

图1是本发明细胞综合检测方法的流程图；

图2是Feulgen染色后效果示意图；

图3是本发明的快速染色后效果示意图；

图4是本发明中根据细胞核DNA含量由大到小的排列细胞形态学图片；

图5是本发明中细胞核DNA定量分析核图谱中一视野的视图；

图6是图5中箭头所指的相应细胞核的全细胞形态图；

图7是图5中箭头所指细胞的细胞核视图；

图8是细胞形态学分析报告。

具体实施方式

下面结合附图实施例，对本发明做进一步描述：

如图1所示流程图，第1步：对切片进行染色处理，使细胞核和细胞质均染上颜色，并且两者所染颜色对比明显，保证在捕捉到的图像中，细胞核和细胞质都能清晰呈现；

第2步：通过检测软件转换通道及非线性校准，过滤细胞质颜色，准确测量细胞核DNA含量，同时采用高分辨率显微镜及数码彩色摄像头采集采集每个细胞核相应的细胞形态学图片及合成完整数字切片；

第3步：根据单个及成团细胞核DNA含量变化结合细胞形态学的变化判断病变细胞。

上述第1步中染色处理包括：

步骤a：将制好的标本自然干燥；

步骤b：将干燥的切片置预处理液中固定10-30分钟，然后流水洗涤4-5次；

步骤c：经过步骤b处理的标本放入50～55℃的盐酸液中酸化5-10分钟，然后流水洗涤4-5次；

步骤d：经过步骤c酸化的标本放入50～55℃的特殊染色液A中染色5-15分钟，然后流水洗涤4-5次；

步骤e：经过步骤d染色的标本用蒸馏水浸洗5分钟；

步骤f：经过步骤d浸洗的标本依次放入50%酒精内脱水2分钟，75%酒精内脱水2分钟，95%酒精内脱水3分钟；

步骤g：经过步骤f逐级脱水后的标本置于特殊染色液B中染色1-5分钟；

步骤h：经过步骤g染色的标本在无水乙醇浸泡两次，每次3分钟；

步骤i：经过步骤h的标本用树胶盖片封固。

上述染色处理中使用的试剂包括预处理液、盐酸液、特殊染色液A和特殊染色液B，其中：

所述预处理液采用AF液、4%多聚甲醛、10%中性甲醛、95%乙醇、BS液中的任意一种或一种以上；

所述盐酸液按质量百分比包含35%～45%浓盐酸、55%～65%蒸馏水；

所述特殊染色液A按质量百分比包含0.10%～1%吩噻嗪类染料、1.8%～2.2%盐酸液、0.09%～0.12%偏重亚硫酸钠、剩余质量百分比由蒸馏水补足，所述吩噻嗪类染料由次甲基蓝、天青A、硫堇中的一种或一种以上组成；

所述的特殊染色液B按质量百分比包含0.005%～0.1%酸性染料、75%～96%醇类试剂、剩余质量百分比由蒸馏水补足，所述酸性染料由伊红、油红O、丽春红2R、比布列西猩红中的一种或一种以上组成，醇类试剂由乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇中的一种或一种以上组成。

上述描述的各个试剂个组分的体积和质量指数提供一种比例关系，并不表示本发明中各个试剂只能用上述的体积和质量。

优选的，上述步骤中的最佳的处理时间为：步骤b固定15分钟，步骤c酸化7分钟，步骤d染色10分钟，步骤f染色3分钟。

第2步中检测软件上将原始绿通道转换为红通道，过滤细胞质颜色；非线性校正过程包括调整光源亮度、图像曝光值、图像灰度偏移值、图像分割阈值补偿参数、贝尔模式（Bayer）模型解析参数、指数模型变换等参数，从而准确测量细胞核DNA含量。

非线性校正的过程具体如下：

步骤（1）：设置一组指数模型变换调节参数、贝尔模式（Bayer）解析调节参数和图像分割阈值补偿参数；

步骤（2）：按常规显微镜调节方式调节DNA检测设备照明、视场光阑、孔径光阑，调节曝光时间在指定的范围区间，图像直方图展示图像亮暗状态在非饱和范围；

步骤（3）：放置一标准切片并设置一个扫描区域，扫描完成后，检查标准切片的IOD（积分光密度）、二倍体细胞标准方差CV，以确定DNA检测设备分辨率是否正常，计算四倍体IOD与二倍体IOD的比值是否符线性关系。将以上参数和质控系统的扫描参数对比，以质控设备为标准，调节指数模型变换参数和Bayer解析参数；

步骤（4）：重复上述步骤（1）-（3），直到同一张标准切片的扫描参数指标IOD（积分光密度）、二倍体细胞标准方差CV以及四倍体IOD与二倍体IOD的线性关系,在DNA检测设备与在标准质控系统扫描得到的参数其差值在允许误差范围内，校正完成。

第2步中数码彩色摄像头采集细胞形态图是在高分辨率显微镜设置为20倍下拍摄，检测人员无需镜下阅片，可根据DNA含量提示，阅读部分图片即可做出诊断，节约阅片人员时间，提高诊断效率。

第3步中的具体步骤包括：

Ⅰ：选取同一切片上的正常细胞做内参细胞，并通过检测软件将所有细胞核按照DNA含量由大到小的顺序排列；

II：DNA含量定量分析时，可观察到相应细胞核的全细胞形态，判断是否为真正的细胞核以及核浆比、形态变化，并对细胞类型作出判断；

III：细胞形态学判读时，检测软件按细胞核DNA含量由大到小排列相应的细胞形态图片，根据DNA含量提示，阅读部分图片即可做出诊断；

Ⅳ：检测软件将多个细胞核重叠即成团核图像分割并且计算这些成团核的DNA含量，再通过细胞学定性分析；

Ⅴ：根据II、III、Ⅳ步骤的综合分析，判断被检测细胞为正常或非正常。

经过上述的染色方法染色细胞标本在高分辨率显微镜及数码彩色摄像头采集下的视图如图3，图2为Feulgen染色后效果示意图，两者对比可知本发明染色后的视图细胞质和细胞核明显区别，可以提供更多形态学信息；图4为第3步中III中所提到根据细胞核DNA含量由大到小排列的细胞形态学图片，显微镜记录每一个视野，并将这些视野图片依据细胞DNA含量异常程度进行自动排序，方便医生诊断时按照细胞异常的程度对数字切片进行复核；图5-7所示为第3步中II的DNA含量定量分析，可观察到相应细胞核的全细胞形态，每一个细胞核下方的数字即为DNA含量，其对应的细胞形态也可以同时看到；图8为胞形态学分析报告将体现最终的结果。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。