一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器及其构建方法和应用与流程

本发明涉及食品安全免疫检测技术领域，具体地，涉及一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器及其构建方法和应用。

背景技术：

丙烯酰胺是一种高水溶性的不饱和酰胺类小分子化合物，对人体具有神经毒性、遗传毒性和生殖毒性，国际肿瘤机构(IARC)把丙烯酰胺列为2A级致癌物质，即人类可能致癌物。研究表明，丙烯酰胺广泛存在于高温加工的还原糖含量高的食品中。生活饮用水是人体摄入丙烯酰胺的主要来源之一，WHO规定饮水中丙烯酰胺限量为0.5μg/L，欧盟规定饮水中限量为0.1μg/L，美国环境保护局规定的限量为0.5μg/L。因此，建立灵敏、快速、简单、高效的丙烯酰胺检测方法具有重大意义。

目前丙烯酰胺的常规检测方法主要是仪器分析法，如气相色谱-质谱联用、高效液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等方法，这些方法需要昂贵复杂的仪器设备和专业的操作人员，加之样品处理繁琐、检测流程复杂、检测费用高，难以满足高通量、现场快速检测的需要，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。

基于抗原-抗体分子识别的免疫分析技术具有检测方法快速简单、检测限低、特异性高、检测成本低等优点，在农药、生物毒素、有机污染物、微生物等分析领域得到了广泛的研究。目前关于丙烯酰胺免疫检测技术的研究报道较少，大多采用传统的ELISA技术。Preston等将3-巯基苯甲酸(3-MBA)与丙烯酰胺的衍生产物Ade-3-MBA作为半抗原，偶联蛋白后免疫兔子得到多克隆抗体，可以特异性地检测识别Ade-3-MBA，由此建立的ELISA检测方法，对水样中丙烯酰胺的检测限为65.7μg/L。赵美萍等于2008年申请了题为“丙烯酰胺全抗原的制备及其酶联免疫定量检测方法”的专利(申请号200710090394.4)，采用N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)为半抗原，建立了丙烯酰胺酶联免疫分析方法，检测限为0.03μg/mL。2011年，Quan等建立了化学发光免疫分析方法，对丙烯酰胺的检测限为18.6ng/mL。

然而，上述免疫分析方法，对丙烯酰胺的检测灵敏度还有待进一步提高。近年来，基于抗原抗体反应的免疫传感器发展迅速。抗原抗体结合前后可导致光学、热学、电化学等方面的信号改变，因此可通过对其测定得到抗原或抗体的浓度。在各类传感器中，电化学免疫传感器具有特异性强、灵敏度高的特点，被广泛应用于生物分析中。近年来，纳米材料被广泛应用于电化学免疫传感器中，纳米材料独特的性能，为光、电信号传导和新一代生物传感的设计提供了优良的载体。纳米材料具有良好的导电性和生物相容性，常作为信号放大可以提高灵敏度。目前，还未存在特异性针对丙烯酰胺的电化学免疫传感器。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器。

本发明的另一个目的是提供一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器的构建方法。

本发明的另一个目的是提供一种利用本发明设计的无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器检测食品中丙烯酰胺的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器，包括基底电极，所述基底电极表面修饰氧化石墨烯/银纳米/壳聚糖纳米复合物后，电化学聚合聚苯胺纳米线，然后电化学沉积金纳米颗粒，固定抗体，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。

如上所述无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器的构建方法，包括以下步骤：

(1)基础电极经抛光、清洗、吹干后，在基础电极表面滴加4～6μL的GO/Ag/CS溶液，烘干，所述GO/Ag/CS溶液是使用0.5mg/mL的GO/Ag溶液与0.1％的CS溶液按照2～4:1的体积比混合而成；

(2)将步骤(1)得到的电极清洗、吹干后，置于含苯胺的硫酸溶液中，利用三电极系统进行CV扫描，得到聚苯胺纳米线修饰的电极；

(3)将步骤(2)得到的电极清洗、吹干后，置于含有氯金酸的硫酸溶液中，利用三电极系统进行CV扫描，得到金纳米颗粒修饰的电极；

(4)将步骤(3)得到的电极清洗、吹干后，在其表面滴加抗体溶液，孵育过夜；

(5)将步骤(4)得到的电极冲洗后，在其表面滴加BSA溶液，水浴反应后，冲洗、吹干即得。

优选地，所述GO/Ag/CS溶液是使用0.5mg/mL的GO/Ag溶液与0.1％的CS溶液按照3:1的体积比混合而成。

优选地，步骤(2)所述苯胺的浓度为0.1～0.2mM，硫酸溶液的浓度为0.3～0.5M。

优选地，步骤(3)所述氯金酸的浓度为1.5～2mM，硫酸溶液的浓度为0.3～0.5M。

如上所述的无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器在检测食品中丙烯酰胺的应用。

优选地，所述食品为油炸食品、膨化食品或曲奇饼干。

一种检测食品中丙烯酰胺的方法，包括如下步骤：

(1)在如上所述的电化学免疫传感器表面滴加待测药物，恒温水浴孵育后冲洗干净；

(2)将上述电极置于铁氰化钾溶液中，利用三电极系统进行微分脉冲伏安法扫描，所述铁氰化钾溶液包含3～5mM的铁氰化钾，3～5mM的亚铁氰化钾，0.1～0.2M的氯化钾。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用导电性和生物相容性好的石墨烯/银纳米/壳聚糖纳米复合物、聚苯胺纳米线、电沉积金纳米颗粒作为基底，可以很好地促进电极表面的电子传递，同时有利于固定抗体并保持其较高的活性，所构建的无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器操作简单、快速，可以应用于食品中丙烯酰胺的高灵敏检测。

附图说明

图1为本发明电化学免疫传感器的原理示意图。

图2氧化石墨烯/银纳米复合物的透射电镜图。

图3免疫传感器修饰过程的循环伏安表征图。

图4为免疫传感器对Acrylamide-4-MPA的线性响应图

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器，制备方法如下：

一、氧化石墨烯/银纳米复合物的制备：首先使用改进的hummers方法制备氧化石墨烯，将H₂SO₄/H₃PO₄(180:20mL)加入到3.0g 325目石墨和18.0g高锰酸钾中，50℃下悬臂搅拌12h，反应物冷却到室温后倒到200mL的冰水中，加入1.5mL 30％的H₂O₂。抽滤后4000rpm离心4h。真空干燥过夜得到氧化石墨烯。取15mg制备好的氧化石墨烯超声分散在30mL水中，透析3h除去多余的离子。磁力搅拌下加入10mL浓度为50mM的银氨溶液，继续搅拌40min，在紫外灯下照射12h。将所得黑色沉淀离心水洗3遍除去多余的银氨离子，真空干燥过夜得到氧化石墨烯/银(GO/Ag)纳米复合材料。

如图2所示为氧化石墨烯/银纳米复合物的透射电镜图，可见银纳米颗粒均匀地分散在片状石墨烯上，90％的银纳米颗粒粒径在8～12nm之间，平均直径约为10nm。

二、无标记型电化学免疫传感器的制备

1、电极的预处理：将玻碳电极用三氧化二铝粉末在麂皮上抛光至镜面，用去离子水冲洗干净，移入超声水浴中清洗3min；然后分别用1：1的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声各清洗5min。清洗好的电极用去离子水冲洗表面，氮气吹干备用。

2、免疫传感器的制备：将1mg GO/Ag超声2h分散到2mL去离子水中，取150μL分散好的GO/Ag加入50μL浓度为0.1％的壳聚糖(CS)。斡旋震荡混匀后，滴加上述GO/Ag/CS溶液5μL到经过预处理的3mm直径的玻碳电极表面，置于37℃烘箱中烘干。用去离子水冲洗修饰了GO/Ag/CS的玻碳电极，氮气吹干后置于5mL含有0.5mmol苯胺的硫酸溶液(0.5M)中，利用三电极系统(玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极)在0～1.0V的电位区间以100mV/s的扫速CV扫描20段，使玻碳电极表面生成聚苯胺纳米线。用去离子水冲洗修饰了苯胺的玻碳电极，氮气吹干。再置于经氮气除氧5min的含有1.87mM的氯金酸的硫酸溶液(0.5M)中，利用三电极系统在-0.1～0.2V的电位区间以50mV/s的扫速CV扫描10段，用去离子水冲洗玻碳电极，氮气吹干。在电极表面滴加5μL按照一定比例稀释的Acrylamide-4-MPA抗体，在4℃孵育过夜以使其固定在电极表面。

上述方法制备的电极用去离子水冲洗，继续滴加10μL BSA并放置在37℃恒温水浴锅2h进行封闭，以消除非特异性吸附。然后用PBS缓冲液(0.01M pH 7.4)反复冲洗干净。最后将制备得到传感器探针保存在4℃环境中备用。

图3所示为免疫传感器修饰过程在4mL铁氰化钾溶液(5mM Fe(CN)₆^3-/4-,0.1M KCl)溶液中的的循环伏安表征图，扫描速度为50mV/s。如图所示，裸玻碳电极(a)在Fe(CN)₆^3-/4-中呈现一对对称的氧化还原峰，峰电流为99.5μA(曲线a)。滴加GO/Ag/CS后还原峰电流增大到126.4μA(曲线b)，这是由于滴加的GO/Ag/CS具有良好的导电性和较大的比表面积加速了电极表面的电子传递。电聚合苯胺后，由于聚苯胺纳米线具有良好的导电性，其氧化还原峰电流进一步增大到187.8μA(曲线c)。电化学沉积氯金酸后在电极表面还原成金纳米颗粒，氧化还原峰电流显著增大至363.3μA(曲线d)，这是由于金纳米颗粒优良的导电性和表面效应促进了电子传递。当电极固定抗体后，其氧化还原峰电流急剧下降至69.5μA(曲线e)，表明不导电的蛋白质分子成功固定到电极上，阻碍了电极表面的电子传递，引起了电流下降。电极不修饰GO/Ag/CS，直接电聚合苯胺和电化学沉积氯金酸的峰电流值分别148.3μA(曲线f)和185.7μA(曲线g)，明显低于修饰了GO/Ag的峰电流，说明GO/Ag/CS作为基底能够和PANINW及GNPs协同作用，增大基底电流，有利于信号的传导。

实施例2

电化学免疫传感器对烯酰胺衍生物Acrylamide-4-MPA标准品的检测，具体方法如下：

1、往封闭好的电极表面滴加5μL不同浓度的Acrylamide-4-MPA，置于37℃恒温水浴锅孵育50min，取出用PBS缓冲液(0.01M pH 7.4)反复冲洗干净。将上述电极置于4mL铁氰化钾溶液(5mM Fe(CN)₆^3-/4-,0.1M KCl)利用三电极系统在-0.2～0.5V的电位区间进行微分脉冲伏安法(DPV)扫描。

2、免疫传感器以GNPs/PANI/GO/Ag/CS作为基底用于固定抗体，具有良好的电子传递性能的纳米材料加速了电子的传递，实现电流信号的放大。采用竞争免疫分析模式，在最优条件下，加入不同浓度的Acrylamide-4-MPA，在铁氰化钾溶液(5mM Fe(CN)₆^3-/4-,0.1M KCl)中利用三电极系统于-0.2～0.5V的电位区间进行微分脉冲伏安法(DPV)扫描，测试不同浓度Acrylamide-4-MPA的电流响应值

图4为免疫传感器对Acrylamide-4-MPA的线性响应图，在0.16～100ng/mL范围内，Acrylamide-4-MPA浓度(C)的对数与电流信号变化(ΔI)的关系为：ΔI＝2.31lgC+4.00，R²为0.9945，免疫传感器的检测限为26pg/mL。

实施例3

免疫传感器的再现性与稳定性测定：为评估构建的免疫传感器的再现性，对每个样品的测量均重复三次。表1是传感器在Acrylamide-4-MPA标准液的浓度分别为100、0.16、0ng/mL时的测量结果，相对标准偏差分别为2.86％、3.77％、12.6％，说明所构建的免疫传感器具有良好的再现性。

表1免疫传感器的再现性

通过定期测量保存在4℃条件下的修饰好的电极随时间的变化，评估免疫传感器的稳定性。结果表明，免疫传感器在3周后的电流响应值保持在80％以上，如表2所示，修饰的电极具有很高的稳定性。

表2传感器的稳定性

实施例4

电化学免疫传感器对食品中丙烯酰胺含量的检测，具体步骤如下：

1、实际样品的提取和纯化：称取5g薯条样品加入20mL甲醇，超声波提取5min，8000rpm/min离心10min，用0.22μm有机膜过滤两次，取10mL上清液，氮气吹干，加入5mL色谱纯甲醇复溶。

2、实际样品的衍生：取1mL纯化后的提取液加入2mL 0.01g/mL的对巯基苯乙酸溶液，50℃震荡反应1h，氮气吹干，加入含95％PB缓冲液和5％甲醇的复溶液溶解目标物，进行电化学免疫分析。

所构建的无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器对薯条的检测回收率在88.7％～104.7％之间，因此该方法可用于食品中丙烯酰胺的检测。

实施例5

一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器，制备方法如下：

一、氧化石墨烯/银纳米复合物的制备：同实施例1。

二、无标记型电化学免疫传感器的制备

1、电极的预处理：将玻碳电极用三氧化二铝粉末在麂皮上抛光至镜面，用去离子水冲洗干净，移入超声水浴中清洗3min；然后分别用1：1的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声各清洗5min。清洗好的电极用去离子水冲洗表面，氮气吹干备用。

2、免疫传感器的制备：将1mg GO/Ag超声2h分散到2mL去离子水中，取100μL分散好的GO/Ag加入50μL浓度为0.1％的壳聚糖(CS)。斡旋震荡混匀后，滴加上述GO/Ag/CS溶液5μL到经过预处理的3mm直径的玻碳电极表面，置于37℃烘箱中烘干。用去离子水冲洗修饰了GO/Ag/CS的玻碳电极，氮气吹干后置于5mL含有1mmol苯胺的硫酸溶液(0.3M)中，利用三电极系统(玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极)在0～1.0V的电位区间以100mV/s的扫速CV扫描20段，使玻碳电极表面生成聚苯胺纳米线。用去离子水冲洗修饰了苯胺的玻碳电极，氮气吹干。再置于经氮气除氧5min的含有1.5mM的氯金酸的硫酸溶液(0.3M)中，利用三电极系统在-0.1～0.2V的电位区间以50mV/s的扫速CV扫描10段，用去离子水冲洗玻碳电极，氮气吹干。在电极表面滴加5μL按照一定比例稀释的Acrylamide-4-MPA抗体，在4℃孵育过夜以使其固定在电极表面。

3、上述方法制备的电极用去离子水冲洗，继续滴加10μL BSA并放置在37℃恒温水浴锅2h进行封闭，以消除非特异性吸附。然后用PBS缓冲液(0.01M pH7.4)反复冲洗干净。最后将制备得到传感器探针保存在4℃环境中备用。

实施例6

一种无标记型丙烯酰胺电化学免疫传感器，制备方法如下：

一、氧化石墨烯/银纳米复合物的制备：同实施例1。

二、无标记型电化学免疫传感器的制备

1、电极的预处理：将玻碳电极用三氧化二铝粉末在麂皮上抛光至镜面，用去离子水冲洗干净，移入超声水浴中清洗3min；然后分别用1：1的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声各清洗5min。清洗好的电极用去离子水冲洗表面，氮气吹干备用。

2、免疫传感器的制备：将1mg GO/Ag超声2h分散到2mL去离子水中，取200μL分散好的GO/Ag加入50μL浓度为0.1％的壳聚糖(CS)。斡旋震荡混匀后，滴加上述GO/Ag/CS溶液5μL到经过预处理的3mm直径的玻碳电极表面，置于37℃烘箱中烘干。用去离子水冲洗修饰了GO/Ag/CS的玻碳电极，氮气吹干后置于5mL含有0.5mmol苯胺的硫酸溶液(0.4M)中，利用三电极系统(玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极)在0～1.0V的电位区间以100mV/s的扫速CV扫描20段，使玻碳电极表面生成聚苯胺纳米线。用去离子水冲洗修饰了苯胺的玻碳电极，氮气吹干。再置于经氮气除氧5min的含有2mM的氯金酸的硫酸溶液(0.4M)中，利用三电极系统在-0.1～0.2V的电位区间以50mV/s的扫速CV扫描10段，用去离子水冲洗玻碳电极，氮气吹干。在电极表面滴加5μL按照一定比例稀释的Acrylamide-4-MPA抗体，在4℃孵育过夜以使其固定在电极表面。

3、上述方法制备的电极用去离子水冲洗，继续滴加10μL BSA并放置在37℃恒温水浴锅2h进行封闭，以消除非特异性吸附。然后用PBS缓冲液(0.01M pH 7.4)反复冲洗干净。最后将制备得到传感器探针保存在4℃环境中备用。