β2微球蛋白半定量金标快速检测试剂盒的制作方法

本实用新型属于临床医学检测领域，具体涉及胶体金免疫层析检测技术。

背景技术：

β2-微球蛋白 (beta2-microglobulin, β2-MG) 是人体细胞表面HLA (human leukocyte antigen，人类白细胞抗原) 的轻链部分，为一条由100个氨基酸残基组成的单键多肽，相对分子质量11.8kDa，由人体间质、上皮及造血系统的正常细胞或恶性细胞合成，存在于除成熟的红细胞和胎盘滋养层细胞外所有细胞表面。正常人β2-MG的合成率及从细胞膜上的释放量相当恒定。

β2-MG是一种分子量相对较小的蛋白，在人体正常血液循环中，β2-MG可经肾小球自由滤过，其中99.9%以上被近曲小管重吸收并分解，故正常人血清和尿液中β2-MG含量相对恒定。当肾小球滤过功能减退时，血清中的β2-MG浓度开始升高，且与肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)呈显著负相关；当肾小管吸收功能减弱或肾小球滤过功能增加时，尿液中β2-MG含量升高，故检测血清或尿液中的β2-MG浓度能反映早期肾功能损伤。由于糖尿病及高血压等慢性病的肾损伤一般首先发生于肾小管位置，因此检测血液或尿液中的β2-MG可监测此类疾病早期肾损伤。

目前，血清或尿液中β2-MG的检测方法主要是免疫比浊法，多由自动生化分析仪分析完成，未有应用胶体金免疫层析法检测β2-MG的报道。本实用新型首次利用胶体金免疫层析法检测血清或尿液中的β2-MG，不仅检测方法简单，结果判读快速，可进行半定量检测，提高对早期肾功能损伤检测的准确度，为临床诊断提供依据。

免疫胶体金技术（immunocolloidal gold technique）是一种新型诊断技术，将其与免疫层析技术结合制作的检测试剂盒具有操作简单、无需冷链及特殊辅助仪器，结果判读快速等优点，其基本原理如下：以高电子密度的酒红色胶体金颗粒标记抗原（或抗体），若样品中存在待检抗体（或待检抗原），则标记后的抗原与样品中待检抗体形成抗原-抗体-胶体金复合物，由毛细作用在硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane)上泳动，并与包被在硝酸纤维素膜上的另一表位抗原（或抗体）结合，形成肉眼可见的红色线条，从而判定待检蛋白的存在；若样品中无待检蛋白或待检蛋白含量未达到阈值，则不会在硝酸纤维素膜上形成可见红线。本实用新型以此技术为基础。

技术实现要素：

本实用新型旨在提供一种半定量检测血清或尿液中β2-MG含量的试剂盒，用于糖尿病及高血压等慢性病早期肾损伤的辅助诊断。本实用新型可解决血清或尿液中β2-MG检测需特殊仪器及耗时长等问题，提供一种检测特异性强、操作简单快速的试剂盒，可广泛用于各级医疗机构的临床检测。

本实用新型包含卡盒、比色卡和试纸条三部分。

所述卡盒包括盒盖和盒底两部分，材质为ABS树脂（丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物）；盒盖与盒底由柱和柱槽以插接方式连接，盒盖与盒底均为圆角长方形；卡盒正面可见检视窗、加样孔和比色窗，检视窗为长椭圆形，加样孔为椭圆形，比色窗为圆角长方形；在检视窗位置可见反应膜、检测线T和质控线C，在加样孔位置可见试纸条样品垫，在比色窗位置可见比色卡上的比色卡标注和色带及对应浓度说明；盒盖正面印有结果判别说明、加样孔标注、品名标注和信息记录栏；盒底下沿右侧开有长方形口用以放入比色卡。

所述比色卡以滑动方式置入卡盒内部，沿盒底上的比色卡槽放置；比色卡上印有比色卡标注、色带及对应浓度说明。

所述试纸条置于卡盒内部，安放在盒底上的试纸条槽中；试纸条由基板、双面胶、样品垫、胶体金垫、胶带、反应膜、吸样垫组成。基板材质为PVC塑料（聚氯乙烯），样品垫及胶体金垫材质为无纺布，反应膜为硝酸纤维素膜，吸样垫材质为油滤纸。所述试纸条使用一对配对性良好的鼠源抗β2微球蛋白单克隆抗体作为检测抗体，分别称为抗体a和抗体b；抗体a用胶体金标记形成抗体a-胶体金复合物并固化于胶体金垫上，抗体b包被于反应膜检测线T位置；质控线C位置包被有羊抗鼠多克隆抗体。

本实用新型应用胶体金免疫层析技术，用于检测血清或尿液中的β2-MG。检测时，若待测样品中含有达到阈值的β2-MG，足量的β2-MG与胶体金垫中的抗体a-胶体金复合物形成 β2-MG-抗体a-胶体金复合物，在毛细作用下，β2-MG-抗体a-胶体金复合物在反应膜上移动，在检测线T处与抗体b结合形成肉眼可见的红色检测线T，而未与β2-MG结合的抗体a-胶体金复合物则越过检测线T与包被在反应膜质控线C位置的羊抗鼠多克隆抗体结合形成红色质控线C；若样本中无达阈值的β2-MG，则检测线T不可见，只见红色质控线C；通过对比观察窗内检测线T颜色与比色窗内色带及对应浓度说明，可对样品中的β2-MG含量做出界定。

本实用新型使用的抗体a和抗体b是针对β2-MG筛选制备的高效价鼠源性配对单克隆抗体，具有高度互补性，提高了样品中β2-MG的检出率和精确性。

本实用新型调整胶体金标记技术，有效组合抗体蛋白，使所述试剂盒可在常温下（4℃~30℃）保存；同时，本实用新型具有免疫胶体金技术操作简单、结果判读快速、无需特殊设备的优点。

附图说明

图1是本实用新型的正面示意图。

图2是本实用新型的比色卡示意图。

图3是本实用新型的盒盖背面示意图。

图4是本实用新型的盒底正面示意图。

图5是本实用新型的试纸条正面示意图。

图6是本实用新型的试纸条侧面示意图。

图中各数字表示内容如下：1.检视窗；2.结果判别说明；3.加样孔标注；4.加样孔；5.品名标注；6.信息记录栏；7.比色窗；8.盒盖；9.比色卡；10.比色卡标注；11.色带及对应浓度说明；12.柱；13.试纸条槽；14.盒底；15.柱槽；16.比色卡槽；17.样品垫；18.胶带；19.反应膜；20.检测线T；21.质控线C；22.吸样垫；23.基板；24.双面胶；25.胶体金垫。

具体实施方式

提供下述实施例是为了进一步理解本实用新型，并不局限于所述最佳实施方式，不对本实用新型的内容和保护范围构成限制，任何人在本实用新型的启示下或是将本实用新型与其他现有技术的特征相组合而得出的任何与本实用新型相同或相似的产品，均落在本实用新型的保护范围之内。

实施例1 一种β2微球蛋白半定量金标快速检测试剂盒

本实用新型由卡盒、比色卡和试纸条三部分组成，卡盒和比色卡选择有资质的供应商进行定制，现结合说明书附图，对试纸条的加工方法进行简述：

所述试纸条的胶体金垫（25）制备方法如下：① 胶体金的制备：在浓度为0.004%~0.012%的氯金酸中加入其体积的1.3%~2%、浓度为1%~3%的柠檬酸三钠，煮沸10~20分钟，得到胶体金溶液；② 胶体金标记抗体a：将①中所得胶体金溶液用0.2M碳酸钾溶液调pH 至8.0~9.0，加入一定量抗体a，置磁力搅拌器上搅拌均匀后，按0.1~0.6g/100ml在溶液中加入动物血清蛋白，4℃静置2小时；③ 将②中所得抗体a-胶体金混合溶液经1000转/分钟离心30分钟，弃上清液；④ 将③中所得沉淀物按4~10ml/100ml溶于0.02M pH 7.4 Tris-Hcl缓冲液（含0.2%~0.6%的动物血清蛋白和0.01%~0.06%叠氮钠）中，得抗体a-胶体金复合物溶液；⑤ 将无纺布浸入④中所得胶体金溶液中，待浸入的无纺布有液体渗出后，37℃干燥，即得包被有抗体a-胶体金复合物的胶体金垫。

所述试纸条反应膜（19）上的检测线T（20）和质控线C（21）的包被方法如下：取高浓度抗体b，调浓度至1mg/ml，加入适量甲醛，用专用喷膜机在反应膜中段包被检测线T；取高浓度羊抗鼠多克隆抗体，调浓度为2mg/ml，加入适量甲醛，用专用喷膜机在反应膜中段距检测线T 4~5mm处包被质控线C；检测线T和质控线C均按10~20μl/ml设置喷量，反应膜完成包被后，立即置入45℃烘箱中，干燥1小时即得。

所述试纸条由基板（23）、双面胶（24）、样品垫（17）、胶体金垫（25）、胶带（18）、反应膜（19）、吸样垫（22）组成，最底层为基板（23），材质为PVC塑料（聚氯乙烯）；基板上附着双面胶（24）一层用于固定基板与其他部件；试纸条前端（图5、图6所示左侧）放置胶体金垫（25），并覆盖一层较长样品垫（17），样品垫及胶体金垫材质为无纺布，抗体a-胶体金复合物固化在胶体金垫上；胶体金垫后端压在反应膜（19）上，并以胶带（18）在上端固定，反应膜材质为硝酸纤维素膜，反应膜上包被有检测抗体（抗体b，即检测线T（20））和质量控制抗体（羊抗鼠多克隆抗体即质控线C（21））；试纸条末端（图5、图6所示右侧）为吸样垫（22），吸样垫前端覆盖反应膜后端，以提供毛细作用力吸收样品余液，吸样垫材质为吸油纸。

所述试纸条以大张方式依次叠放黏贴之后，裁剪成长5.8~6.0cm，宽4mm的窄条，放置在试剂盒盒底（14）的试纸条槽（13）内；将盒盖（8）上的柱（12）与盒底上的柱槽（15）对齐，以插接方式进行连接；使用时将比色卡从盒底下沿右侧长方形开口放入试剂盒。

使用所述试剂盒检测方法如下：将干燥密封的试剂盒取出，平放在实验室台面上，将比色卡从卡盒下沿右侧开口置入卡盒比色卡槽内，在比色窗内确认看到比色卡；用移液器吸取待测样本（血清或尿液）100μL加入加样孔，同时将样本编号填写在盒盖正面信息记录栏，开始观察结果；20分钟内有效，观察检视窗处质控线C和检测线T是否显红色；若质控线C和检测线T显红色，则对比检测线T与比色窗内色带及对应浓度说明（11）的颜色，以确定样本中β2-MG的含量范围。

所述试剂盒检测结果解释如下：

仅出现质控线C时，说明样本中的β2-MG含量小于0.65μg/mL；

当出现质控线C，且检测线T的颜色与比色窗内标记为0.65μg/mL的色带相比较深，而与标记为1.00μg/mL的色带相比较浅时，说明样本中β2-MG含量大于0.65μg/mL而小于1.00μg/mL；

当出现质控线C，且检测线T的颜色与比色窗内标记为1.00μg/mL的色带相比较深，而与标记为5.00μg/mL的色带相比较浅时，说明样本中β2-MG含量大于1.00μg/mL而小于5.00μg/mL；

当出现质控线C，且检测线T的颜色与比色窗内标记为5.00μg/mL的色带相比较深，而与标记为10.0μg/mL的色带相比较浅时，说明样本中β2-MG含量大于5.00μg/mL而小于10.0μg/mL；

当出现质控线C，且检测线T的颜色与比色窗内标记为10.0μg/mL的色带相比较深，而与标记为20.0μg/mL的色带相比较浅时，说明样本中β2-MG含量大于10.0μg/mL而小于20.0μg/mL；

当出现质控线C，且检测线T的颜色与比色窗内标记为20.0μg/mL的色带相比较深时，说明样本中β2-MG含量大于20.0μg/mL；

当加样20分钟后，检视窗无红色线条出现，则说明该试剂盒无效。

实施例2 一种β2微球蛋白半乳胶免疫层析半定量检测试剂盒

该试剂盒的组成结构除金标垫（25）由彩色乳胶垫代替外，其他条件与实施例1相同，所述彩色乳胶垫除了所用标记物为彩色乳胶外，其制备方法同金标垫。