一种定量检测试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种定量检测试剂盒，适用于各种DNA的定量检测。
背景技术：
：在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对DNA进行准确定量。在临床诊断方面，病毒DNA的定量检测是临床诊断的重要依据。SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。SYBRGreenI核酸凝胶染液是一种高敏感性的荧光染液，可用于检测琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶中的双链DNA和寡核苷酸。当染液与核酸结合后，SYBRGreenI核酸凝胶染液的荧光信号会明显增强，因此经SYBRGreenI核酸凝胶染液染色的凝胶显示出非常好的性价比，没有背景荧光。目前，常规利用SYBRGreenI荧光染料检测DNA含量的方法存在以下方面的不足：1、PCR扩增过程中SYBRGreenI荧光染料与DNA结合的方法存在非特异性扩增导致定量不准确的风险；2、SYBRGreenI荧光染料直接作用于样本存在对样本含量、检测仪器灵敏度要求高的问题，检测成本较高，而且样本中其他杂质也会对检测结果造成一定影响，导致定量不准确。技术实现要素：针对以上现有技术问题，本实用新型的目的在于提供一种定量检测试剂盒，排出了样本中其他杂质和非特异性扩增产物对最终检测结果的影响，更准确、低成本的完成DNA含量的定量检测，包括以下步骤：粗滤；琼脂糖凝胶电泳；DNA回收；SYBRGreenI荧光染色；检测及结果分析。该方法利用简化的DNA回收方法得到高纯度的DNA，再通过SYBRGreenI染色和紫外分光光度计检测荧光，计算分析得到DNA浓度。具体技术方案如下：一种定量检测试剂盒，包括盒体，支架，第一EP管以及第二EP管，其中，所述盒体内设置支架；所述支架上设有4-6个管架；所述第一EP管设置于第一管架上，所述第一EP管底部设有钻孔，管内设有定性滤纸；所述第二EP管设置于第二管架上，所述第二EP管底部设有钻孔，管内设有定性滤纸；所述第一EP管为0.5ml或1.5ml容量的EP管，所述第二EP管为0.5ml或1.5ml容量的EP管。还包括盒盖，所述盒盖一侧连接至盒体并用于扣合盒体。还包括第三EP管，第四EP管，第五EP管以及第六EP管，分别设置于支架的第三管架，第四管架，第五管架以及第六管架上。上述定量检测DNA含量的SYBRGreenI定量检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：(1)粗滤；(2)琼脂糖凝胶电泳；(3)DNA回收；(4)SYBRGreenI荧光染色；(5)检测；(6)结果分析。进一步地，步骤(1)中包括：(1-1)取待测样品放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；(1-2)将套好的EP管离心，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体全部进行琼脂糖凝胶电泳。进一步地，步骤(2)中包括：(2-1)配胶；(2-2)电泳准备；(2-3)上样；(2-4)电泳。进一步地，步骤(3)中包括：(3-1)将切下来的含目的DNA的胶块切碎，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；(3-2)将套好的EP管离心，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体定容；(3-3)加入NaAc和无水乙醇，冷冻；沉淀干燥后溶于TE溶液。进一步地，步骤(4)中包括：(4-1)加入与DNA复溶液等体积的稀释好的SYBRGreenI工作液，混匀；(4-2)放置30分钟左右。进一步地，步骤(5)中包括：(5-1)将染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度计上，260nm波长处分别读取荧光值A260；(5-2)根据WdsDNA＝A260×50μg/ml公式换算待测样品中目的DNA含量。进一步地，(2-1)配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶；取适量的琼脂和TAE缓冲液至锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，放入微波炉煮，煮好的凝胶应无气泡、色泽均匀；将煮好的凝胶放入65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，加入适量的SYBRGreenI荧光染料，及时将凝胶倒入装好的干净电泳模具中；待凝胶完全凝固后，小心的将梳子拔出；(2-2)电泳准备：把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入一定量的TAE缓冲液至刚好将凝胶淹没；(2-3)上样：将样品、6×溴酚蓝按5：1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样；(2-4)电泳：上样后，盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电泳参数：120V30min。本实用新型方法操作简便、成本低廉、准确度高。附图说明图1为已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管示意图图2为套入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5mlEP的1.5ml的EP管示意图图3为定量检测DNA含量的SYBRGreenI定量检测试剂盒具体实施方式下面根据附图对本实用新型进行详细描述，其为本实用新型多种实施方式中的一种优选实施例。在一个优选实施例中，一种定量检测DNA含量的SYBRGreenI定量检测试剂盒及其检测方法，进一步地包括以下步骤：(1)粗滤：①取待测样品100μl，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；②将套好的EP管在4℃10000rpm下离心10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体全部进行琼脂糖凝胶电泳；(2)琼脂糖凝胶电泳：①配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。取适量的琼脂和TAE缓冲液至锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，放入微波炉煮，煮好的凝胶应无气泡、色泽均匀。将煮好的凝胶放入65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，加入适量的SYBRGreenI荧光染料，及时将凝胶倒入装好的干净电泳模具中。待凝胶完全凝固后，小心的将梳子拔出；②电泳准备：把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入一定量的TAE缓冲液至刚好将凝胶淹没；③上样：将样品、6×溴酚蓝按5：1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样；④电泳：上样后，盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电泳参数：120V30min；(3)DNA回收：①将切下来的含目的DNA的胶块切碎，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；②将套好的EP管在4℃10000rpm下离心10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体用移液枪定容；③加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍体积的无水乙醇，在-20℃冷冻30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。(4)SYBRGreenI荧光染色：①加入与DNA复溶液等体积的稀释好的SYBRGreenI工作液(稀释比例根据SYBRGreenI的说明书)，混匀；②放置30分钟。(5)检测及结果分析：①将染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度计上，260nm波长处分别读取荧光值A260；②根据WdsDNA＝A260×50μg/ml公式换算待测样品中目的DNA含量。粗滤步骤①取待测样品100μl，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；DNA回收步骤①将切下来的含目的DNA的胶块切碎，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；DNA回收步骤②将套好的EP管在4℃10000rpm下离心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体用移液枪定容；DNA回收步骤③加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍体积的无水乙醇，在-20℃冷冻30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。在另一个优选实施例中，一种SYBRGreenI荧光染料定量检测DNA含量的方法，通过粗滤、琼脂糖凝胶电泳、DNA回收、SYBRGreenI荧光染色、检测及结果分析完成待测样品DNA的定量检测，具体包括以下步骤：1、粗滤：(1)取待测样品100μl，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；(2)将套好的EP管在4℃10000rpm下离心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体全部进行琼脂糖凝胶电泳；2、琼脂糖凝胶电泳：(1)配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。取适量的琼脂和TAE缓冲液至锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，放入微波炉煮，煮好的凝胶应无气泡、色泽均匀。将煮好的凝胶放入65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，加入适量的SYBRGreenI荧光染料，及时将凝胶倒入装好的干净电泳模具中。待凝胶完全凝固后，小心的将梳子拔出；(2)电泳准备：把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入一定量的TAE缓冲液至刚好将凝胶淹没；(3)上样：将样品、6×溴酚蓝按5：1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样；(4)电泳：上样后，盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电泳参数：120V30min；3、DNA回收：(1)将切下来的含目的DNA的胶块切碎，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；(2)将套好的EP管在4℃10000rpm下离心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体用移液枪定容；(3)加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍体积的无水乙醇，在-20℃冷冻30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。4、SYBRGreenI荧光染色：(1)加入与DNA复溶液等体积的稀释好的SYBRGreenI工作液(稀释比例根据SYBRGreenI的说明书)，混匀；(2)放置30分钟。5、检测及结果分析：(1)将染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度计上，260nm波长处分别读取荧光值A260；(2)根据WdsDNA＝A260×50μg/ml公式换算待测样品中目的DNA含量。应用本实用新型检测待测样品A中基因片段长度约1kb的DNA含量，同时设定一组已知DNA浓度(30ng/μl)的标准对照，经过粗滤和琼脂糖凝胶电泳，再经过DNA回收、SYBRGreenI荧光染色和检测及结果分析，测得结果如表2：样本名称A260DNA含量待测样品A0.0170.85ng/μl标准对照0.59829.9ng/μl表2如图1所示，该EP管包含已在底部钻好孔的0.5ml的EP21和定性滤纸22。如图2所示，该EP管包含已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管31和1.5ml的EP管32。如图3所示，该试剂盒包括图1所示的已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管41和图2所示的套入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5mlEP的1.5ml的EP管42。当前第1页1 2 3