本发明涉及基质和包括基质的诊断试剂盒，用于鉴定母乳中2’岩藻糖基聚糖的缺乏(岩藻糖基转移酶-2(fut2)相关聚糖)。此外，本发明涉及包括这种诊断试剂盒和2’岩藻糖基聚糖的成套试剂盒。
背景技术：
人乳包含多种不同的低聚糖，其中大部分低聚糖是岩藻糖基化的，参见例如，newburg,janimsci,2009；87(suppl1)；26-34(newburg，《动物科学杂志》，2009年，第87卷(增刊1)，第26-34页)。然而，不同女性合成不同亚类的低聚糖，并且人乳低聚糖的总量和相对丰度也在哺乳期期间变化。
经发现，人与人之间最明显的差异与人乳低聚糖岩藻糖基化有关并且这种差异是基于由遗传决定的女性分泌型和路易斯血型状态。
大多数女性表达岩藻糖基转移酶ii(fut2)，其通过α-1,2-键将岩藻糖连接至末端半乳糖。此外，一些女性表达岩藻糖基转移酶iii(fut3)，其通过α-1,4-键将岩藻糖连接至n-乙酰基葡糖胺。表达fut2和fut3两者的女性被称为路易斯阳性分泌型；只表达fut2的女性被称为路易斯阴性分泌型；只表达fut3的女性被称为路易斯阳性非分泌型；既不表达fut2也不表达fut3的一小部分女性被称为路易斯阴性非分泌型。汇总如下：非分泌型女性不产生α-1,2-连接的岩藻糖基化低聚糖，占所有欧洲女性的20％-25％(newburgetal,glycobiol,2004；14(3)；253-263(newburg等人，《糖生物学》，2004年，第14卷第3期，第253-263页))。
由于许多肠道病原菌例如弯曲杆菌菌种(其引起腹泻)与2’-岩藻糖基化聚糖结合，所述聚糖在提供给婴儿时似乎具有重要作用，因为所述聚糖似乎与肠道病原菌结合。这样阻止这些病原菌附接到肠黏膜的表面。实际上已经证实，相比于进食具有低α-1,2-连接的低聚糖总量的乳汁的母乳喂养婴儿，进食具有高α-1,2-连接的低聚糖总量的人乳的母乳喂养婴儿得到更好保护，免于腹泻(参见以上newburg,janimsci(newburg，《动物科学杂志》))。
类似的教导内容可见于newburgetal,glycobiol(参见以上newburg等人，《糖生物学》)，在该文献中来自分泌型母亲(le(a-/b+)和le(a-/b-))的乳汁中α-1,2-连接的岩藻糖基化低聚糖和非-1,2-连接的岩藻糖基化低聚糖之间的比例与其母乳喂养婴儿腹泻的频率相关联。作者推断，母乳中α-1,2-连接的低聚糖含量与婴儿患上腹泻风险之间存在明显关系。
纽迪希亚公司(nutricia)公布的wo2011/136648专注于使用包含人乳低聚糖(hmo)(诸如2-岩藻糖基化低聚糖)的组合物来制备用于喂食婴儿(所述婴儿为分泌型)的营养组合物并且也描述了用2-岩藻糖基化低聚糖补充来自非分泌型母亲的乳汁的方法。
但是，该专利申请未提及有利地预防和/或治疗婴儿或幼儿的urt感染，如名称为compositionsforuseinthepreventionortreatmentofurtinfectionsininfantsoryoungchildrenatrisk(用于预防或治疗有风险婴儿或幼儿的urt感染的组合物)的非预先公布专利申请pct/ep14/074555(现已公布为wo2015/071389)中所述；或者未提及有利地预防和/或治疗婴儿或幼儿的变态反应，如名称为compositionsforpreventingortreatingallergiesininfantfromorfedbynon-secretormothersbyprovidingfucosylated-oligosaccharidesinparticularamonginfantsatriskorbornbyc-section(通过提供岩藻糖基化低聚糖预防或治疗非分泌型母亲诞下或喂养的婴儿尤其是有风险的婴儿或剖腹产婴儿的变态反应的组合物)的非预先公布专利申请pct/ep14/073623(wo2015/071131)中所述。
在这篇最后的专利申请中，还表明不同母亲的不同人母乳中2fl含量的变化很大。该图说明了，在出生后前几个月内给婴儿喂养的母乳中的2fl含量与变态反应风险(2岁时发生湿疹和特应性疾病)之间的相关性。这证明母亲的非分泌型状态并不是预测变态反应风险的唯一因素，人母乳中的岩藻糖基化低聚糖的量也是预测该风险的另一个因素。在出生后前几个月内给婴儿喂养的母乳中的岩藻糖基化低聚糖(例如，2fl)的含量越低，发生变态反应(尤其是特应性疾病，例如特应性皮炎或湿疹)的风险就越高。
由于母乳中2’-岩藻糖基化聚糖的量可能变化很大，因此这可能对婴儿的健康产生极大影响，因此明显需要定期测量这一量。可通过hpaec分析进行鉴定和定量，如已在wo2012/069416中描述。但是，这也并不是可定期进行和在家里进行的价格低廉的简单分析。
此外，还期望手边有一定剂量的2’岩藻糖基聚糖以补充缺乏这些化合物的母乳。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供如上所述的基质，其包含一系列聚糖结合蛋白(诸如凝集素或适于结合2’岩藻糖基聚糖的抗体)以及一系列结合母乳蛋白质的阳性对照物。根据实施方案，所述基质是多孔的并且允许母乳化合物(诸如糖蛋白、一系列聚糖结合蛋白(诸如凝集素或适于结合2’岩藻糖基聚糖的抗体)以及一系列结合母乳蛋白质的阳性对照物)通过毛细作用力运输。特别地，聚糖结合蛋白为来自荆豆(ulexeuropaeus)的植物凝集素。更特别地，阳性对照物包含特定乳蛋白质(如乳清蛋白)的特异性抗体或其片段。优选已经用不同染料标记聚糖结合蛋白和阳性对照物两者。
根据本发明的另一个实施方案，诊断试剂盒包括根据本发明的一种或多种基质以及设置有乳汁施加窗口和读出窗口的适于接收这种基质的设备。
根据本发明的又一个实施方案，成套试剂盒包括根据本发明的诊断试剂盒以及一个或多个2’岩藻糖基聚糖的喂食剂量诸如100mg-5000mg，例如1000mg-5000mg，例如2000mg-5000mg。应当理解，这些量可根据婴儿和幼儿的年龄和体重而变化。优选的是，成套试剂盒包括诊断试剂盒，其中2’岩藻糖基聚糖包含2’岩藻糖基乳糖。
本发明的成套试剂盒用于鉴定母乳中2’岩藻糖基聚糖的缺乏并用于补充这种缺乏。优选的是，本发明的成套试剂盒用于补充2’岩藻糖基聚糖至诸如100mg-5000mg，例如1000mg-5000mg，例如2000mg-5000mg、3000mg-5000mg、4000mg-5000mg的日剂量。应当理解，这些量可根据婴儿和幼儿的年龄和体重而变化。
附图说明
图1表示包括下列的诊断试剂盒
基质(1)，该基质(1)具有一系列来自荆豆的植物凝集素和乳清蛋白特异性抗体以及棒状形式的塑性设备(3)，该棒状形式的塑性设备(3)包括乳汁施加窗口(6)和读出窗口(5)。基质(1)集成在设备中，以虚线(4)表示。
具体实施方式
如本文所用，下列术语具有如下含义。
术语“2’岩藻糖基聚糖”或“2-岩藻糖基化低聚糖”或“α-1,2-连接的岩藻糖基化低聚糖”可互换使用并且具有完全相同的含义：hmo包含2’岩藻糖基表位。
术语“hmo”或“hmos”是指人乳低聚糖。这些碳水化合物高度耐受酶水解，这表明其表现的重要功能可能不与其热值直接相关。本领域已特别指出，这些碳水化合物在婴儿和幼儿的早期发育(诸如，免疫系统成熟)过程中发挥关键作用。在人乳中发现了许多不同种类的hmo。每种单独的低聚糖的结构都以葡萄糖、半乳糖、唾液酸(n-乙酰神经氨酸)、岩藻糖和/或n-乙酰基葡糖胺与这些分子间各式各样的键的组合为基础，因此人乳含有大量种类各不相同的低聚糖，迄今已鉴定出逾130种低聚糖结构。几乎所有低聚糖的还原端都有乳糖部分，同时非还原端的末端位置都由唾液酸和/或岩藻糖(如果存在)占据。hmo可以呈酸性(例如，含带电唾液酸的低聚糖)或呈中性(例如，岩藻糖基化低聚糖)。
“岩藻糖基化低聚糖”是具有岩藻糖残基的低聚糖。这种低聚糖呈中性。一些实施例为2-fl(2'岩藻糖基乳糖)、3-fl(3-岩藻糖基乳糖)、二岩藻糖基乳糖、乳糖-n-岩藻戊糖(例如，乳糖-n-岩藻戊糖i、乳糖-n-岩藻戊糖ii、乳糖-n-岩藻戊糖iii、乳糖-n-岩藻戊糖v)、乳糖-n-岩藻己糖、乳糖-n-二岩藻己糖i、岩藻糖基乳糖-n-己糖、岩藻糖基乳糖-n-新己糖、二岩藻糖基乳糖-n-己糖i、二岩藻糖基乳糖-n-新己糖ii，以及这些物质的任意组合。尽管不希望受理论约束，但据信，岩藻糖基化低聚糖的岩藻糖基表位可在粘膜表面处充当“诱饵(decoy)”。该表位可利用竞争效应来防止和/或限制病原体(病毒或细菌来源)或病原体所分泌组分(例如毒素)引发感染，尤其是避免病原体或病原体所分泌组份与天然配体结合，从而将降低感染(特别是urt感染或变态反应)风险。
“包含2’-岩藻糖基表位的岩藻糖基化低聚糖”和“2-岩藻糖基化低聚糖”的表述涵盖了具有一定同源形式的岩藻糖基化低聚糖，因为这些同源形式的岩藻糖基化低聚糖都包含2’-岩藻糖基表位，因而可推测它们具有一定同源功能。虽然并不希望受理论约束，但据信，这些岩藻糖基化低聚糖的2’-岩藻糖基-表位特别针对与urt感染或变态反应相关的病原体(或其分泌的组分)。一些示例为2-fl(2’岩藻糖基乳糖)、二岩藻糖基乳糖、乳糖-n-岩藻戊糖、乳糖-n-岩藻己糖、乳糖-n-二岩藻己糖、岩藻糖基乳糖-n-己糖、岩藻糖基乳糖-n-新己糖、二岩藻糖基乳糖-n-己糖、二岩藻基-乳糖-n-新己糖、二岩藻糖基乳糖-n-新己糖、岩藻糖基-对-乳糖-n-己糖，以及这些物质的任意组合。
乳糖-n-岩藻戊糖的示例为乳糖-n-岩藻戊糖i。
术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的小孩。
表述“幼儿”是指年龄介于一岁和三岁之间的小孩，也称为学步儿童。
表述“预防urt感染”是指避免发生urt感染并且/或者降低urt感染的发生率(降低urt感染的频率，亦即减少urt感染的次数)。预防urt感染是在治疗期间(即，服用本发明的组合物期间)完成的。也可涵盖在以后的生活中预防urt感染。表述“在以后的生活中”涵盖干预或治疗结束后的效果。这种效果“在以后的生活中”可维持1周至数月，例如，2至4周、2至6周、2至8周、1至6个月，或2至12个月。
表述“治疗urt感染”应当理解为包括缩短urt感染的持续时间(婴儿或幼儿患urt感染的天数/周数/年数)、减轻urt感染的严重程度(urt感染的后果和/或严重性)。这种表述还涵盖缓解症状(例如咳嗽、咽喉痛、流鼻涕、鼻充血、头痛、低热、面部胀感、打喷嚏，以及这些的组合)，和/或减轻urt感染所致、对婴儿或幼儿的健康产生不良影响的并发症(例如中耳炎，有时是支气管炎)，和/或减轻疼痛，和/或减轻疲乏感，和/或促进安然入睡，和/或平息患urt感染婴儿或幼儿的烦躁不安。
“母乳”应理解为母乳或母亲的初乳。
所谓“母乳中缺乏2’岩藻糖基聚糖”或“母乳缺失岩藻糖基转移酶-2(fut2)相关聚糖”是指母乳缺少、几乎不含或不含2-岩藻糖基聚糖。这种乳汁可能不含(或几乎不含)岩藻糖基化低聚糖，或含少量岩藻糖基化低聚糖，诸如存在的量不足常见母乳中岩藻糖基化低聚糖平均含量的50％、或40％、或35％、或30％、或25％、或20％、或15％、或10％、或5％、或3％或2％；或者喂给婴儿或幼儿的母乳中至少一种2-岩藻糖基化低聚糖不足，其中“不足”是指所述2-岩藻糖基化低聚糖的浓度小于3000mg/l、小于2000mg/l、小于1000mg/l、小于500mg/l、小于300mg/l、小于100mg/l、小于50mg/l、小于10mg/l、1mg/l。
可通过层析或过滤技术从天然来源诸如动物乳汁中分离以喂食剂量使用的2’岩藻糖基化低聚糖。或者，可利用特定的2’岩藻糖基转移酶，采用生物技术手段制得岩藻糖基化低聚糖，其中生物技术手段包括基于酶(重组酶或天然酶)的发酵技术、或微生物发酵技术。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可经工程改造产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(dp)的受体底物为起始物逐步(从dp＝1开始)形成岩藻糖基化低聚糖。或者，可以通过由乳糖和游离岩藻糖化学合成来制备2’岩藻糖基化低聚糖。岩藻糖基化低聚糖也可从(例如)日本协和发酵工业株式会社(kyowa,hakko,kogyo,japan)购得。或者，可以利用岩藻糖基水解酶和合适岩藻糖供体底物诸如连接至载体的岩藻糖的逆反应来制备岩藻糖基聚糖。
除非另外指明，否则所有百分比均按重量计。
现在开始更详细讲述本发明。应当注意，本申请描述的多个方面、特征、实施例和实施方案可以相容和/或可以组合到一起。
另外，在本发明的上下文中，术语“包含”或“包括”不排除其他可能的要素。本发明(包括本文所述的多个实施方案)的组合物可包含下列要素、由或基本上由下列要素组成：本文所述的基本要素和必要限制，以及本文所述的任何其它或可选(或者说视需求来定)的成分、组分或限制。
本发明的第一目的是提供诊断试剂盒，以简单便利的方式分析母乳中存在还是不存在2’岩藻糖基聚糖和/或其含量，这种试剂盒也可在家里使用。
在第一实施方案中，这种诊断试剂盒包括
-一种或多种基质，这些基质允许母乳化合物(例如由二氧化硅、一系列适于结合2’岩藻糖基聚糖的来自荆豆的植物凝集素以及一系列结合母乳蛋白质的阳性对照物(两者用不同染料标记)组成)通过毛细作用力运输，以及
-设备，该设备适于接纳基质，具有乳汁施加窗口和读出窗口以进行分析，
其中通过接纳不同基质，该设备可使用若干次。
利用一种类型的基质，将乳汁样品施加至施加窗口将导致小分子乳汁组分诸如岩藻糖基聚糖迁移。当到达凝集素和抗体系列时，这些物质将随乳汁一起迁移。结合其相应底物(岩藻糖基聚糖或特定乳蛋白质)的凝集素和抗体将迁移较少并且到达读出窗口的高度。出现两条带表明，测试是有效的(阳性对照)并且存在2’岩藻糖基聚糖。如果不存在2’岩藻糖基聚糖，第二条带将迁移到读出窗口之外并且看不到。
如果出现两条带，带的强度将指示2’岩藻糖基聚糖的相对量。读出窗口上见到的对应于带强度的诸如从1至4标度将设置在设备上。该标度将允许选择所提供2’岩藻糖基聚糖的最佳补充剂量。
在本发明的另选实施方案中，基质将具有聚糖结合蛋白诸如凝聚素和抗体，该凝聚素和抗体以一定方式定位以致施加乳汁将导致颜色出现或淬灭，而凝集素或抗体未迁移。在该实施方案中，优选应当用荧光染料标记聚糖结合蛋白和抗体，以及提供光源以在设备上读取颜色出现和淬灭。颜色的强度将指示2’岩藻糖基聚糖的相对量。
可以将诊断试剂盒的施用原理与其它众所周知的免疫测试相比较。
本发明的第二目的是提供成套试剂盒，以简单、便利且价格低廉的方式分析母乳中2’岩藻糖基聚糖的含量，并且提供喂食剂量的所述聚糖以补充最终缺乏。
根据本发明的成套试剂盒包括：
-如上所公开的诊断试剂盒
-一个或多个2’岩藻糖基聚糖的喂食剂量以补充母乳喂养(如有必要)。
如果标记为2’岩藻糖基聚糖的用染料着色的系列未移动，而对照物已移动，如图1所举例说明，则母乳不含2’岩藻糖基聚糖。
在那种情况下，应当以一定量给予母乳喂养的婴儿或幼儿一个或多个2’岩藻糖基聚糖的喂食剂量，以致达到0.1g-5g/日，尤其2g-5g/日的量。
此外，标记为2’岩藻糖基聚糖的用染料着色的系列并非只表明存在2’岩藻糖基聚糖，而且淬灭颜色的强度也与2’岩藻糖基聚糖的量相关。
可通过以若干种方式例如下列方式提供喂食剂量而实现喂食额外的2’岩藻糖基聚糖：
溶解在水或少量母乳中以允许优选在正常母乳喂养期期间通过匙或注射器以一定量施加，以给予婴儿或幼儿至少上述最低量。
然而，喂食剂量的2’岩藻糖基聚糖也可加入到其它营养组合物如水果或蔬菜中给予。
如所指出的那样，设备可重复用于接纳新基质，每次读出存在于母乳中2’岩藻糖基聚糖的量。
实施例
图1示出根据本发明的诊断试剂盒，其包括具有一系列来自荆豆的植物凝集素和一系列乳清蛋白特异性抗体(两者均与染料结合)的矩形基质(1)。该基质可将系列所在的面放入乳汁中。然后，应当在乳汁施加窗口(6)高度处将该基质具有系列的面放入透明设备(3)中位置(4)处。利用读出窗口(5)，应当确定系列的位置以及2’岩藻糖基聚糖的存在，前提条件是表示乳清蛋白的对照系列的位置出现在预期位置上。