本发明涉及辅助骨髓纤维症(myelofibrosis：mf)的状态的诊断的方法、辅助mf的预后预测的方法、及mf的治疗效果的监测方法。另外，本发明涉及用于执行这些方法的装置。再者，本发明涉及骨髓纤维化状态的判断用标志物。
背景技术：
骨髓纤维症是骨髓增殖性肿瘤的一种，是在骨髓中发生广泛的纤维化的疾病。骨髓纤维化的结果，变得在骨髓以外的场所、特别是在脾脏造血，从而发生脾肿大。骨髓纤维症分类为原因不明的原发性骨髓纤维症和继基础疾病而续发的二次性骨髓纤维症的2种。在原发性骨髓纤维症中，由从异常增殖的巨核细胞分泌的各种细胞因子的刺激，成纤维细胞增殖而产生网状纤维或胶原纤维，骨髓的纤维化发展。二次性骨髓纤维症从真性多血症、原发性血小板血症等的造血器肿瘤迁移的情况多，病态与原发性骨髓纤维症相同。
在骨髓纤维症的诊断中，通过将从患者采集的骨髓用显微镜观察(骨髓活体检查)而确认骨髓的纤维化。纤维化的状态基于作为who采用的半定量评价基准的“europeanconsensusongradingofbonemarrowfibrosis”而评价。在此基准中，纤维化的状态分类为mf-0、mf-1、mf-2及mf-3的4个等级。由于骨髓纤维化与病期并行进行，得知可由骨髓纤维化的状态预测患者的预后。例如，在非专利文献1中，通过将骨髓纤维化的状态用上述的基准分类，预测初期的骨髓纤维症患者的预后。
提示骨髓纤维症的发病与调节细胞因子的信号传递的被称为janus激酶(jak)的激酶的基因变异相关。在原发性骨髓纤维症中，有报告称在约半数的患者中确认到jak2基因的变异。另外，在专利文献1中公开了基于受试者的jak2基因的指定的变异的存在或不在的测定而进行骨髓增殖性疾病的诊断或预后判断的方法。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：国际公开第2010/051214号单行本
【非专利文献】
非专利文献1：gianelliu.等,modernpathology,vol.25,p.1193-1202,2012
技术实现要素：
【发明要解决的技术课题】
骨髓纤维化的状态是掌握骨髓纤维症发展至何程度，在进行治疗时对于确认其效果必要的信息。另外，骨髓纤维化的状态是对于患者的预后预测也有用的信息。一方面，在专利文献1记载的方法中，通过对特定的jak2变异的存在的有无进行测定，进行骨髓增殖性疾病的诊断，但无法掌握骨髓纤维化的状态，或掌握骨髓纤维症的发展的程度。因此，研究骨髓纤维化的状态的手段目前仅有骨髓活体检查。但是，由于骨髓的采集对患者的负担极大，无法为了研究骨髓纤维化的状态而频繁地进行骨髓活体检查。另外，在骨髓纤维化的评价中，要求病理组织学检查的技术和经验。再者，由于在骨髓纤维症的施用治疗中有每日服用高价的治疗药的必要，从而有为了确认施用治疗的有效性而以比以往更高的频度研究骨髓纤维化的状态的期盼。所以，期望对患者的负担小，并且使骨髓纤维化的状态的客观的评价成为可能的手段的开发。
【解决课题的技术方案】
本发明人发现，通过以骨髓纤维症患者的末梢血中所含的指定的糖蛋白质作为生物标志物而进行测定，可客观地评价骨髓纤维化的状态，从而完成本发明。
从而，本发明的第1实施方式提供辅助骨髓纤维症的状态的诊断的方法，其包括：对从骨髓纤维症的患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质进行测定的工序，及基于此标志物蛋白质的测定值而判断上述患者的骨髓纤维化的状态的工序，此标志物蛋白质是有与多花紫藤凝集素(wisteriafloribundaagglutinin：wfa)凝集素结合的糖链的mac-2结合蛋白(mac-2-bindingprotein：m2bp)。
本发明的第2实施方式提供辅助骨髓纤维症的预后的预测的方法，其包括：对从骨髓纤维症的患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质进行测定的工序，及基于此标志物蛋白质的测定值而判断上述患者的预后的工序，此标志物蛋白质是有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp。
本发明的第3实施方式提供骨髓纤维症的治疗效果的监测方法，其包括：对从受对于骨髓纤维症的治疗的骨髓纤维症的患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质进行测定的工序，及基于此标志物蛋白质的测定值而判断骨髓纤维症的治疗效果的工序，此标志物蛋白质是有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp。
本发明的第4实施方式提供，存在于骨髓纤维症的患者的末梢血中、且由有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp构成的骨髓纤维化状态的判断用标志物。
本发明的第5实施方式提供骨髓纤维症的状态诊断装置，其具备含处理器及处于此处理器的控制下的存储器的计算机，在上述存储器中记录有用于使上述计算机执行下列工序的计算机程序：取得从骨髓纤维症的患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质的测定值的工序，及基于此标志物蛋白质的测定值而判断上述患者的骨髓纤维化的状态的工序，上述标志物蛋白质是有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp。
本发明的第6实施方式提供骨髓纤维症的预后预测装置，其具备含处理器及处于此处理器的控制下的存储器的计算机，在上述存储器中记录有用于使上述计算机执行下列工序的计算机程序：取得从骨髓纤维症的患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质的测定值的工序，及基于此标志物蛋白质的测定值而判断上述患者的预后的工序，上述标志物蛋白质是有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp。
本发明的第7实施方式提供骨髓纤维症的治疗效果的监测装置，其具备含处理器及处于此处理器的控制下的存储器的计算机，在上述存储器中记录有用于使上述计算机执行下列工序的计算机程序：取得从受对于骨髓纤维症的治疗的骨髓纤维症的患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质的测定值的工序，及基于此标志物蛋白质的测定值而判断骨髓纤维症的治疗效果的工序，上述标志物蛋白质是有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp。
【发明效果】
本发明对于在试样的采集中的患者的负担小，并且，能客观地评价骨髓纤维化的状态。
【附图说明】
【图1】是显示用骨髓活体检查分类的mf-0/1组及mf-2/3组的各自的wfa+-m2bp的测定值的箱线图。
【图2】是为了算出wfa+-m2bp的测定值的截止值而制成的roc曲线。
【图3】是显示用骨髓活体检查分类的mf-0组、mf-1组、mf-2组及mf-3组的各自的wfa+-m2bp的测定值的箱线图。
【图4】是显示jak抑制剂的施用导致的骨髓纤维症患者的wfa+-m2bp的测定值的变化的坐标图。
【图5】是显示骨髓纤维症的状态的诊断装置的一例的概略图。
【图6】是显示骨髓纤维症的状态的诊断装置的硬件构成的框图。
【图7】是使用骨髓纤维症的状态的诊断装置的骨髓纤维症的状态的判断的流程图。
【图8】是使用骨髓纤维症的预后的预测装置的预后判断的流程图。
【图9】是使用骨髓纤维症的治疗效果的监测装置的治疗效果的判断的流程图。
【图10a】是显示jak抑制剂的施用导致的骨髓纤维症患者a的wfa+-m2bp的测定值的变化的坐标图。
【图10b】是显示jak抑制剂的施用导致的骨髓纤维症患者b的wfa+-m2bp的测定值的变化的坐标图。
【图10c】是显示jak抑制剂的施用导致的骨髓纤维症患者c的wfa+-m2bp的测定值的变化的坐标图。
【图11a】是将在jak抑制剂的施用前后从骨髓纤维症患者a采集的骨髓苏木精(he)染色、银染色及马森三色染色之时的显微镜照片。
【图11b】是将在jak抑制剂的施用前后从骨髓纤维症患者c采集的骨髓he染色、银染色及马森三色染色之时的显微镜照片。
【实施方式】
[1.诊断骨髓纤维症的状态的方法]
在本实施方式的诊断骨髓纤维症的状态的方法(以下，也简称为“诊断方法”)中，首先，作为从骨髓纤维症的患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质，对有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp进行测定。
骨髓纤维症的患者(以下，也称为“mf患者”)只要是基于公知的诊断基准而被诊断为原发性骨髓纤维症或二次性骨髓纤维症的者即可。在本实施方式中，对于mf患者，年龄、性别、症状、基础疾病、治疗史、与骨髓纤维症相关的基因(例如jak2基因等)的变异等不特别限定。
在本实施方式中，作为血液试样，可使用从mf患者采集的末梢血，也可使用由该末梢血调制的血浆或血清。在它们之中，也优选血清。在本实施方式中，根据需要，也可将血液试样用适合的水性介质稀释。这样的水性介质只要是不妨碍后述的测定，就不特别限定，例如，可举出水、生理盐水、缓冲液等。缓冲液只要是在中性附近的ph(例如6以上8以下的ph)有缓冲作用，就不特别限定。这样的缓冲液，例如，可举出hepes、mes、tris、pipes等的good缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(pbs)等。
在本实施方式中测定的标志物蛋白质是有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp(以下，也称为“wfa+-m2bp”)。如m2bp一样，有糖链的蛋白质称为糖蛋白质。糖蛋白质，一般知，随产生的组织及细胞的种类或状态而糖链的结构不同。本发明人发现，在从健康人得到的血液试样中几乎不存在wfa+-m2bp，在从mf患者得到的血液试样中存在wfa+-m2bp，及该试样中的wfa+-m2bp的测定值和mf患者的骨髓纤维化的状态相关，特别是，可将预后良好(低风险)的mf-0/1组的患者和预后不良(高风险)的mf-2/3组的患者通过wfa+-m2bp的测定值和截止值的比较进行分类。
对wfa+-m2bp进行测定的手段只要是可取得反映血液试样中所含的wfa+-m2bp的量或浓度的值(以下，也称为“wfa+-m2bp的测定值”)，就不特别限定。在本实施方式中，优选使用能与wfa+-m2bp所具有的糖链(即，与wfa凝集素结合的糖链)特异性地结合的物质而捕获wfa+-m2bp的方法。也可通过将由这样的物质捕获的wfa+-m2bp用现有技术中公知的方法检测，对血液试样中所含的wfa+-m2bp进行测定。作为能与wfa+-m2bp所具有的糖链特异性地结合的物质，特别优选wfa凝集素。wfa凝集素本身，作为藤的种子中所含的凝集素被知，可一般地得到。另外，也能使用能与wfa凝集素同样地与wfa+-m2bp所具有的糖链特异性地结合的抗体。
天然存在的wfa凝集素是由4个亚基构成的4聚体蛋白质。从此4聚体的wfa凝集素可由使用还原剂等的指定的处理得到单体或2聚体的wfa凝集素。在本说明书中，只要是不特别说明，“wfa”及“wfa凝集素”的表述是指单体的wfa凝集素及多聚体的wfa凝集素的两方。另外，在本说明书中，当表示由指定的数的亚基构成的wfa凝集素时，如例如“单体wfa”、“2聚体wfa”、“4聚体wfa”一样，明确表示亚基的数。
在本实施方式中，wfa凝集素可为4聚体wfa，也可为从4聚体wfa得到的单体wfa或2聚体wfa。在它们之中，从与wfa+-m2bp的反应性的高度来看，也优选2聚体wfa。
在本实施方式中，从与wfa凝集素特异性地结合的物质之中确定m2bp而测定的观点来看，除了wfa凝集素之外，优选使用抗m2bp抗体而测定血液试样中所含的wfa+-m2bp。具体而言，首先，通过将血液试样、wfa凝集素和抗m2bp抗体混合，使含wfa+-m2bp、wfa凝集素及抗m2bp抗体的复合物形成。在此复合物中，wfa凝集素与wfa+-m2bp的糖链结合，抗m2bp抗体与wfa+-m2bp的蛋白质部分结合。
抗m2bp抗体只要是可与wfa+-m2bp的蛋白质部分特异性地结合的抗体，就不特别限定。抗m2bp抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、及它们的片段(例如，fab、f(ab')2等)的任何。另外，也可使用市售的抗m2bp抗体。
将血液试样、wfa凝集素和抗m2bp抗体混合的顺序不特别限定，可为将这些基本上同时混合，也可为依次混合。
在本实施方式中，优选使含wfa+-m2bp、wfa凝集素及抗m2bp抗体的复合物在固相上形成。例如，也可使含上述的复合物的溶液和可捕获wfa凝集素或抗m2bp抗体的固相接触。或者，也可将wfa凝集素或抗m2bp抗体预先固定于固相上而使用。例如，通过使固定了wfa凝集素(或者抗m2bp抗体)的固相与血液试样和抗m2bp抗体(或者wfa凝集素)接触，可使上述的复合物在固相上形成。进而，通过将在固相上形成的复合物用现有技术中公知的方法检测，可对血液试样中所含的wfa+-m2bp的量或浓度进行测定。
wfa凝集素或抗m2bp抗体向固相的固定的实施方式不特别限定。例如，可使wfa凝集素或抗m2bp抗体和固相直接结合，也可为wfa凝集素或抗m2bp抗体和固相之间经别的物质而间接结合。作为直接结合，例如，可举出物理吸附等。作为间接结合，例如，可举出经生物素与亲和素或链霉亲和素(以下，也称为“亲和素类”)的组合的结合。此时，将wfa凝集素或抗m2bp抗体预先用生物素修饰，通过使亲和素类预先结合于固相，经生物素和亲和素类的结合而可使wfa凝集素或抗m2bp抗体和固相间接结合。
固相的原料不特别限定，例如，可从有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等选择。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可使这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定，例如，可举出粒子、膜、微平板、微管、试管等。在它们之中，也优选粒子，特别优选磁性粒子。
在本实施方式中，也可在复合物的形成和后述的测定之间，进行除去未形成复合物的未反应的游离成分的b/f分离。未反应的游离成分是指不构成复合物的成分。例如，可举出不与wfa+-m2bp结合的wfa凝集素或抗m2bp抗体等。b/f分离的手段不特别限定，如果固相是粒子，可通过由离心分离回收仅捕获复合物的固相而进行b/f分离。如果固相是微平板或微管等的容器，可通过除去含未反应的游离成分的液而进行b/f分离。另外，当固相是磁性粒子时，可通过在用磁铁磁约束磁性粒子的状态下由喷嘴吸除含未反应的游离成分的液而进行b/f分离，从自动化的观点是优选的。在除去未反应的游离成分之后，也可将捕获复合物的固相用pbs等的适合的水性介质清洗。
在本实施方式中，优选使用固定于磁性粒子的wfa凝集素和由标记物质标记的抗m2bp抗体(以下，也称为“标记抗m2bp抗体”)而测定血液试样中所含的wfa+-m2bp。通过使用固定了wfa凝集素的磁性粒子，wfa凝集素和试样中的wfa+-m2bp的反应性提高。
固定于磁性粒子的wfa凝集素优选为使4聚体wfa成为2聚体而得到的2聚体wfa。2聚体wfa，例如，可使用巯基试剂或还原剂，使4聚体wfa的亚基解离而得到。另外，通过使交联剂和4聚体wfa接触，也可使4聚体wfa成为2聚体wfa。作为这样的交联剂，优选与4聚体wfa中的氨基形成交联的交联剂。例如，作为对于氨基的反应基，可举出有选自n-羟基琥珀酰亚胺酯基、n-羟基琥珀酰亚胺酯基、异硫氰基、氯砜基、氯羰基、氧乙烯基、碳原子数1～4的氯烷基、醛基及羧基的至少1种官能团的交联剂。如果使用这样的交联剂，可使4聚体wfa有效地变成2聚体wfa。
将4聚体wfa和交联剂混合时的摩尔比(wfa/交联剂)优选为1/10以下，更优选为1/20以下。一方面，摩尔比(wfa/交联剂)的下限可考虑交联剂的使用量及与生成的2聚体wfa的收率的平衡而设为1/100以上。
当经生物素和亲和素类的结合而将wfa凝集素固定于磁性粒子时，也可使用生物素化2聚体wfa。生物素化2聚体wfa，例如，可通过使用含生物素的交联剂而使4聚体wfa凝集素成为2聚体而得到。含生物素的交联剂，例如，通过使生物素和交联剂的上述反应基经间隔物而结合而得到。这样的间隔物不特别限定，例如，可举出有氨基己酰基(氨基己酰基)的化合物等。
在标记抗m2bp抗体中使用的标记物质只要是发生能检测的信号，就不特别限定。例如，可为其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)，也可为催化其他物质的反应而使信号发生的物质。作为信号发生物质，例如，可举出荧光物质、放射性同位元素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，例如，可举出酶。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(fitc)、若丹明、alexafluor(注册商标)等的荧光染料、gfp等的荧光蛋白质等。作为放射性同位元素，可举出125i、14c、32p等。在它们之中，作为标记物质，也优选酶，特别优选碱性磷酸酶。
标记抗m2bp抗体由现有技术中公知的标记方法，将抗m2bp抗体用上述的标记物质标记而得到。另外，也可使用市售的标记试剂盒等进行标记。
在本实施方式中，通过检测由复合物中所含的标记抗m2bp抗体的标记物质发生的信号，可取得反映血液试样中所含的wfa+-m2bp的量或浓度的测定值。其中，“检测信号”含定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及半定量检测信号的强度。半定量的检测是指将信号的强度如“不发生信号”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中，优选定量或半定量检测信号的强度。
检测信号的方法本身在现有技术中公知。在本实施方式中，根据来源于上述的标记物质的信号的种类适宜选择测定方法即可。例如，当标记物质是酶时，可通过使用分光光度计等的公知的装置测定通过使对于该酶的底物反应而发生的光、色等的信号而进行。
酶的底物可根据该酶的种类而从公知的底物适宜选择。例如，当作为酶使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出cdp-star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、cspd(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光基质、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(bcip)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。
当标记物质是放射性同位素时，可使用闪烁计数器等的公知的装置测定作为信号的放射线。另外，当标记物质是荧光物质时，可使用荧光酶标仪等的公知的装置测定作为信号的荧光。再者，激发波长及荧光波长可根据使用的荧光物质的种类适宜确定。
信号的检测结果可作为wfa+-m2bp的测定值使用。例如，当定量检测信号的强度时，可将信号强度的测定值本身或从该测定值算出的值作为wfa+-m2bp的测定值使用。作为从信号强度的测定值算出的值，例如，可举出自该测定值减去阴性对照试样的测定值的值、该测定值除以阳性对照试样的测定值的值、及它们的组合等。作为阴性对照试样，可举出不含健康者血清等的wfa+-m2bp的血液试样。作为阳性对照试样，可举出以指定的浓度含wfa+-m2bp的血液试样。
接下来，在本实施方式的诊断方法中，基于上述的wfa+-m2bp的测定值而判断mf患者的骨髓纤维化的状态。
上述的判断优选通过确定是否mf患者的骨髓纤维化的状态在根据骨髓纤维化的发展的程度设定的多个阶段之中，相当于任何的阶段而进行。作为这样的阶段，也可使用在现有技术中公知的骨髓纤维化的判断基准定的等级等。作为优选的例，可举出在“europeanconsensusongradingofbonemarrowfibrosis”中定的等级(mf-0、mf-1、mf-2及mf-3)。再者，mf-0～mf-3的各等级基于从mf患者采集的骨髓的病理组织学观察结果。mf-0相当于正常骨髓，是指未确认到网状纤维的交叉像的骨髓。mf-1是指在血管周围见到网状纤维的交叉像及缓慢的网络的骨髓。mf-2是指确认到弥漫性、且高密度的网状纤维的交叉像，在局部见到胶原纤维束或骨硬化观察结果的骨髓。mf-3是指确认到弥漫性、且高密度的网状纤维的交叉像，见到粗壮的胶原纤维束或明显的骨硬化观察结果的骨髓。
上述的阶段的数不特别限定，通常只要是2、3或4阶段即可。例如，当以2阶段判断骨髓纤维化的状态时，也可判断骨髓纤维化的状态在以mf-0、mf-1、mf-2及mf-3表示的骨髓纤维化的等级之中，是相当于mf-0/1的等级，或者是相当于mf-2/3的等级。其中，“mf-0/1”是指mf-0及mf-1的任一者，相当于前纤维化期。“mf-2/3”是指mf-2及mf-3的任一者，相当于纤维化期。另外，当以4阶段判断骨髓纤维化的状态时，可判断骨髓纤维化的状态相当于在以mf-0、mf-1、mf-2及mf-3表示的骨髓纤维化的等级之中的何等级。
在本实施方式中，优选对wfa+-m2bp的测定值和指定的截止值进行比较，基于该比较的结果而判断骨髓纤维化的状态。例如，如果以2阶段判断骨髓纤维化的状态，在wfa+-m2bp的测定值与指定的截止值相同或比其高时，判断为骨髓纤维化的状态相当于mf-2/3的等级。相反，当wfa+-m2bp的测定值比指定的截止值低时，判断为骨髓纤维化的状态相当于mf-0/1的等级。
上述的指定的截止值不特别限定，例如，通过对于mf患者而蓄积骨髓活体检查和末梢血中的wfa+-m2bp的测定值的数据，可依经验设定。或者，也可如以下一样设定指定的截止值。从由骨髓活体检查分类的mf-0、mf-1、mf-2及mf-3的各等级的mf患者采集末梢血，取得wfa+-m2bp的测定值。进而，从取得的值求出能区别mf-0、mf-1、mf-2及mf-3的值、或者，能区别mf-0/1和mf-2/3的值，以该值作为指定的截止值设定。
[2.辅助骨髓纤维症的预后预测诊断的方法]
如上所述，在骨髓纤维症中，由于骨髓纤维化与病期并行进行，可由骨髓纤维化的状态预测患者的预后。从而，如果可由本实施方式的诊断骨髓纤维症的状态的方法判断mf患者的骨髓纤维化的状态，则也能预测该患者的预后。从而，在本发明的范围中，也含辅助骨髓纤维症的预后的预测的方法(以下，也简称为“预测方法”)。
在本实施方式的预测方法中，首先，作为从mf患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质，对wfa+-m2bp进行测定。再者，对于本实施方式的预测方法中的mf患者及wfa+-m2bp的测定，与在本实施方式的诊断方法中所述的相同。
接下来，在本实施方式的预测方法中，基于wfa+-m2bp的测定值而预测上述的mf患者的预后。其中，mf患者的预后的预测也可解释为预测影响该患者的生存期间的风险的高低。即，当预测为mf患者是高风险时，mf患者的预后不良，预测为生存期间比较短。另外，当预测为mf患者是低风险时，mf患者的预后良好，预测为生存期间比较长。
在本实施方式中，优选对wfa+-m2bp的测定值和指定的截止值进行比较，基于该比较的结果而预测mf患者的预后。例如，当wfa+-m2bp的测定值与指定的截止值相同或比其高时，预测为mf患者是高风险。相反，当wfa+-m2bp的测定值比指定的截止值低时，预测为mf患者是低风险。指定的截止值可与在本实施方式的诊断方法中所述的同样地设定。
[3.骨髓纤维症的治疗效果的监测方法]
在现有技术中，骨髓纤维症的治愈及生存期间的延长包括在骨髓纤维症的治疗目标中。骨髓纤维症的治愈是指骨髓内的异常细胞及纤维化消失的状态。在本实施方式的诊断方法中，由于可基于wfa+-m2bp的测定值而判断骨髓纤维化的状态，通过对在治疗的前后的wfa+-m2bp的测定值进行比较，监测由治疗改善骨髓的纤维化与否变得可能。从而，在本发明的范围中，也含骨髓纤维症的治疗效果的监测方法(以下，也简称为“监测方法”)。
在本实施方式的监测方法中，首先，作为从受对于骨髓纤维症的治疗的骨髓纤维症的患者采集的末梢血中所含的标志物蛋白质，对wfa+-m2bp进行测定
mf患者只要是受对于骨髓纤维症的治疗，就不特别限定。对于骨髓纤维症的治疗法不特别限定，可为在现有技术中公知的治疗法，也可为对于骨髓纤维症的有效性未知的治疗法。对于骨髓纤维症的治疗法可为药物疗法及非药物疗法的任一者。作为现有技术中公知的药物疗法，可举出使用称为羟基脲、烷基化剂(例如美法仑等)、免疫调节药(例如沙利度胺、来那度胺等)及jak抑制剂(例如鲁索替尼等)的现有技术中公知的骨髓纤维症治疗药的治疗。在它们之中，也优选使用jak抑制剂的治疗，特别优选使用鲁索替尼的治疗。作为现有技术中公知的非药物疗法，例如，可举出输血疗法、骨髓移植、脾脏摘出、放射线疗法等。
在本实施方式中，为了监测治疗效果，优选继续采集mf患者的末梢血而测定wfa+-m2bp。血液采集的时期及频度等不特别限定，可适宜确定，优选至少每3个月进行一次，根据需要，也可以短于3个月的间隔进行。一般而言，mf患者由于治疗开始后短暂期间有为了观察经过而去医院的必要，在其去医院时，也可采集末梢血。另外，在要对治疗的前后骨髓纤维化的状态进行比较时，只要在治疗前采集末梢血即可。
对于本实施方式的监测方法中的wfa+-m2bp的测定与在本实施方式的诊断方法中所述的相同。wfa+-m2bp的测定也可在血液的采集时进行。或者，保存由采集的血液或其调制的血浆或血清，对于此保存的血液试样而可在任意的时间点进行测定。
接下来，在本实施方式的监测方法中，基于wfa+-m2bp的测定值而判断骨髓纤维症的治疗效果。在本实施方式中，治疗效果可使用wfa+-m2bp的测定值判断，也可使用基于wfa+-m2bp的测定值而判断的骨髓纤维化的状态判断。
当使用wfa+-m2bp的测定值判断时，优选通过对wfa+-m2bp的测定值(优选为，现在的测定值)和过去测定的wfa+-m2bp的测定值进行比较进行。过去测定的wfa+-m2bp的测定值可使用预先对过去从mf患者取得的血液试样进行测定而得到的wfa+-m2bp的测定值。或者，也可通过保存过去从mf患者取得的血液试样，与该mf患者的现在的血液试样一同对保存的血液试样进行测定，使用与现在的wfa+-m2bp的测定值同时取得的测定值。
在本实施方式中，例如，在现在的wfa+-m2bp的测定值比过去的wfa+-m2bp的测定值减少时，可判断为确认到治疗效果。另外，在从过去的wfa+-m2bp的测定值判断的状态是相当于mf-2/3的状态，从现在的wfa+-m2bp的测定值判断的状态是相当于mf-0/1的状态时，可判断为确认到显著的治疗效果。
当使用骨髓纤维化的状态判断时，例如，也可通过判断骨髓纤维化的状态相当于前纤维化期或相当于纤维化期来进行。或者，也可比较基于wfa+-m2bp的测定值而判断的骨髓纤维化的状态和骨髓纤维症的诊断时进行的骨髓活体检查的结果而判断治疗效果。
[4.标志物]
在本发明的范围中，也含用于骨髓纤维化的状态的判断的标志物。(以下，也简称为“标志物”)。这样的本实施方式的标志物存在于骨髓纤维症的患者的末梢血中，由有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp构成。在本实施方式中，可对mf患者来源的血液试样中的标志物进行测定，基于得到的测定值而判断该患者的骨髓纤维化的状态。再者，对于标志物(即，wfa+-m2bp)的测定及骨髓纤维化的状态的判断与至今所述的相同。再者，在本发明的范围中，也含有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp用于骨髓纤维化状态的判断的用途。
[5.装置]
在本发明的范围中，也含用于实施上述的本实施方式的方法的装置。这样的装置是骨髓纤维症的状态的诊断装置(以下，也简称为“诊断装置”)、骨髓纤维症的预后的预测装置(以下，也简称为“预测装置”)及骨髓纤维症的治疗效果的监测装置(以下，也简称为“监测装置”)。
接下来，参照附图说明用于实施上述的本实施方式的方法的装置的一例。但是，本实施方式不仅限定于此例中所示的形态。图5是mf患者的骨髓纤维化的状态的诊断装置的概略图。图5所示的诊断装置10含免疫测定装置20和与该免疫测定装置20连接的计算机系统30。再者，预测装置及监测装置的硬件构成与诊断装置相同。
在本实施方式中，免疫测定装置的种类不特别限定，可根据wfa+-m2bp的测定方法而适宜选择。在图5所示的例中，免疫测定装置20是能检测由使用固定wfa凝集素的磁性粒子及酶标记抗m2bp抗体的夹心elisa法发生的化学发光信号的市售的自动免疫测定装置。免疫测定装置20只要是能基于使用的标记物质的信号的检测，就不特别限定，可根据标记物质的种类而适宜选择。免疫测定装置20也可具备将血液试样、含固定wfa凝集素的固相的试剂和含标记抗m2bp抗体的试剂混合而执行抗原抗体反应的装置。
如果将含固定wfa凝集素的磁性粒子的试剂、含酶标记抗m2bp抗体的试剂及从患者采集的血清设置在免疫测定装置20，则该免疫测定装置20使用各试剂而执行抗原抗体反应，作为基于与wfa+-m2bp特异性地结合的酶标记抗体的光学信息而取得化学发光信号，向计算机系统30发送得到的光学信息。
计算机系统30含计算机本体300、输入部301和显示受试体信息或判断结果等的显示部302。计算机系统30从免疫测定装置20接收光学信息。进而，计算机系统30的处理器执行基于光学信息而判断安装在硬盘313中的mf患者中的纤维化的状态的程序。再者，计算机系统30，如图5所示，可为与免疫测定装置20不同的机器，也可为内包免疫测定装置20的机器。后者的情况，计算机系统30也可以其本身成为诊断装置10。再者，除了预测装置在硬盘313上安装有进行mf患者的预后预测诊断的程序、监测装置在硬盘313上安装有判断在mf患者中的治疗效果的程序之外，两者具备与诊断装置10同样的构成。另外，也可在市售的自动免疫测定装置上搭载上述的纤维化状态判断程序、预后预测程序及/或治疗效果判断程序。
参照图6，计算机本体300具备cpu(中央处理器)310、rom(只读存储器)311、ram(随机访问存储器)312、硬盘313、输入输出接口314、读取装置315和通信接口316和图像输出接口317。cpu310、rom311、ram312、硬盘313、输入输出接口314、读取装置315、通信接口316及图像输出接口317能由总线318数据通信地连接。另外，免疫测定装置20由通信接口316，与计算机系统30能通信地连接。
cpu310能执行存储到rom311或硬盘313中的程序及加载到ram312上的程序。cpu310算出wfa+-m2bp的测定值，读取存储到rom311或硬盘313中的指定的截止值，判断mf患者的骨髓纤维化的状态。cpu310输出判断结果而显示于显示部302。
rom311由掩模型rom、prom、eprom、eeprom等构成。在rom311中，如前所述记录有由cpu310执行的计算机程序及在所述计算机程序的执行中使用的数据。也可在rom311中记录有指定的截止值、过去的wfa+-m2bp的测定值等在后述的判断流程中使用的数据。
ram312由sram、dram等构成。ram312用于在rom311及硬盘313中记录的程序的读取。另外，ram312在执行这些程序之时，作为cpu310的作业区域被利用。
硬盘313上安装有用于使cpu310执行的操作系统、应用程序(上述的纤维化状态判断程序、预后预测诊断程序及/或治疗效果判断程序)等的计算机程序及在所述计算机程序的执行中使用的数据。也可在硬盘313中记录有指定的截止值、过去的wfa+-m2bp的测定值等在后述的判断流程中使用的数据。
读取装置315由软盘驱动器、cd-rom驱动器、dvd-rom驱动器等构成。读取装置315可读取在可移动型记录介质40中记录的程序或数据。
输入输出接口314，例如，由usb、ieee1394、rs-232c等的串行接口，scsi、ide、ieee1284等的并行接口和由d/a变换器、a/d变换器等构成的模拟接口构成。在输入输出接口314上连接键盘、鼠标等的输入部301。操作者能由该输入部301向计算机本体300输入各种指令。
通信接口316是例如，ethernet(注册商标)接口等。计算机本体300还能由通信接口316，向打印机等发送印刷数据。
图像输出接口317与由lcd、crt等构成的显示部302连接。由此，显示部302可输出对应于从cpu310给出的图像数据的影像信号。显示部302根据输入的影像信号而显示图像(画面)。
参照图7，对于由诊断装置10执行的mf患者中的骨髓纤维化的状态的判断流程进行说明。其中，以从由使用固定wfa凝集素的磁性粒子及酶标记抗m2bp抗体的夹心elisa法发生的化学发光信号取得wfa+-m2bp的测定值，使用取得的测定值而进行判断的情况作为例说明。但是，本实施方式不仅限定于此例。
在步骤s101中，cpu310从免疫测定装置20取得光学信息(化学发光信号)，从取得的光学信息算出wfa+-m2bp的测定值而存储在硬盘313中。在步骤s102中，cpu310对算出的wfa+-m2bp的测定值和存储在硬盘313中的指定的截止值进行比较。当wfa+-m2bp的测定值与指定的截止值相同或比其高时，处理进到步骤s103，将显示骨髓纤维化的状态相当于mf-2/3的判断结果存储在硬盘313中。一方面，当wfa+-m2bp的测定值比指定的截止值低时，处理进到步骤s104，将显示骨髓纤维化的状态相当于mf-0/1的判断结果存储在硬盘313。在步骤s105中，cpu310输出判断结果，显示于显示部302，或由打印机打印。由此，可将辅助mf患者的骨髓纤维化的状态的诊断的信息提供于医师等。
参照图8，对于由本实施方式的预测装置执行的mf患者的预后预测流程进行说明。步骤s201与步骤s101同样，从由上述的夹心elisa法发生的化学发光信号取得wfa+-m2bp的测定值。在步骤s202中，cpu310对在步骤s201中算出的wfa+-m2bp的测定值和存储在硬盘313中的指定的截止值进行比较。当wfa+-m2bp的测定值与指定的截止值相同或比其高时，处理进到步骤s203，将显示mf患者是高风险(预后不良)的判断结果存储在硬盘313中。一方面，当wfa+-m2bp的测定值比指定的截止值低时，处理进到步骤s204，将显示mf患者是低风险(预后良好)的判断结果存储在硬盘313。在步骤s205中，cpu310输出判断结果，显示于显示部302，或由打印机打印。由此，可将辅助mf患者的预后预测的信息提供于医师等。
参照图9，对于由本实施方式的监测装置执行的骨髓纤维症的治疗效果的判断流程进行说明。再者，在此例中，对于作为过去测定的wfa+-m2bp的测定值(以下，也称为“过去的测定值”)而使用预先对过去取得的血液试样进行测定而得到的测定值而进行判断的情况进行说明。但是，本实施方式不仅限定于此例。作为过去的测定值，也可使用保存过去从mf患者取得的血液试样，通过与该mf患者的现在的血液试样一同对保存的血液试样进行测定而与现在的测定值同时取得的测定值。
步骤s301与步骤s101同样，从由上述的夹心elisa法发生的化学发光信号取得wfa+-m2bp的测定值。在步骤s302中，cpu310对在步骤s301中算出的wfa+-m2bp的测定值和存储在硬盘313中的过去的测定值进行比较。当wfa+-m2bp的测定值比过去的测定值低时，处理进到步骤s303，将显示mf患者所受的治疗有效果的判断结果存储在硬盘313中。一方面，当wfa+-m2bp的测定值与过去的测定值相同或比其高时，处理进到步骤s304，将显示mf患者所受的治疗无效果的判断结果存储在硬盘313中。在本实施方式中，在步骤s308中，cpu310也可输出上述的判断结果而结束流程。
在本实施方式中，当判断为有治疗效果时，也可进一步进行骨髓纤维化的状态的判断。参照图9，在步骤s305中，cpu310对算出的wfa+-m2bp的测定值和存储在硬盘313中的指定的截止值进行比较。当wfa+-m2bp的测定值比指定的截止值低时，处理进到步骤s306，将显示骨髓纤维化的状态相当于mf-0/1的判断结果存储在硬盘313中。一方面，当wfa+-m2bp的测定值与指定的截止值相同或比其高时，处理进到步骤s307，将显示骨髓纤维化的状态相当于mf-2/3的判断结果存储在硬盘313中。在步骤s308中，cpu310输出判断结果，显示于显示部302，或由打印机打印。由此，可将辅助对骨髓纤维症的治疗的效果的判断的信息提供于医师等。
在本发明的范围中，也含为了制造骨髓纤维症的状态的诊断装置而使用上述的免疫测定装置及计算机。从而，本发明提供下述的用途：
其为免疫测定装置及计算机用于制造骨髓纤维症的状态的诊断装置的用途，
该免疫测定装置具备：
将从骨髓纤维症患者采集的血液试样、含固定wfa凝集素的固相的试剂和含标记抗m2bp抗体的试剂混合而执行抗原抗体反应的装置，和
将基于与wfa+-m2bp特异性地结合的标记抗m2bp抗体的信号作为wfa+-m2bp的测定值而取得的装置，
该计算机具备：
存储器，其存储免疫测定装置取得的wfa+-m2bp的测定值及指定的截止值，及
处理器，其对存储的wfa+-m2bp的测定值和指定的截止值进行比较，基于比较结果而进行骨髓纤维症的状态的判断。
在本发明的范围中，也含为了制造骨髓纤维症的预后的预测装置而使用上述的免疫测定装置及计算机。从而，本发明提供下述的用途：
其为免疫测定装置及计算机用于制造骨髓纤维症的预后的判断装置的用途，
该免疫测定装置具备：
将从骨髓纤维症患者采集的血液试样、含固定wfa凝集素的固相的试剂和含标记抗m2bp抗体的试剂混合而执行抗原抗体反应的装置，和
将基于与wfa+-m2bp特异性地结合的标记抗m2bp抗体的信号作为wfa+-m2bp的测定值而取得的装置，
该计算机具备：
存储器，其存储免疫测定装置取得的wfa+-m2bp的测定值及指定的截止值，及
处理器，其对存储的wfa+-m2bp的测定值和指定的截止值进行比较而基于比较结果而进行上述患者的预后的判断。
在本发明的范围中，也含为了制造骨髓纤维症的治疗效果的监测装置而使用上述的免疫测定装置及计算机。从而，本发明提供下述的用途：
其为免疫测定装置及计算机用于制造骨髓纤维症的治疗效果的监测装置的用途，
该免疫测定装置具备：
将从受对于骨髓纤维症的治疗的患者采集的血液试样、含固定wfa凝集素的固相的试剂和含标记抗m2bp抗体的试剂混合而执行抗原抗体反应的装置，及
将基于与wfa+-m2bp特异性地结合的标记抗m2bp抗体的信号作为wfa+-m2bp的测定值而取得的装置，
该计算机具备：
存储器，其存储免疫测定装置取得的wfa+-m2bp的测定值及指定的截止值，及
处理器，其对存储的wfa+-m2bp的测定值和指定的截止值进行比较，基于比较结果而进行对骨髓纤维症的治疗效果的判断。
在上述的使用中，免疫测定装置优选具备：将血液试样、含固定wfa凝集素的磁性粒子的试剂和含酶标记抗m2bp抗体的试剂混合而执行抗原抗体反应的装置，及将基于与wfa+-m2bp特异性地结合的酶标记抗体的化学发光信号作为wfa+-m2bp的测定值而取得的装置。
在上述的使用中，计算机也可还具备用于使用者输入各种指令的输入装置、例如鼠标、键盘等。另外，在上述的用途中，计算机还可具备用于显示判断结果的显示装置，例如由lcd、crt等构成的显示装置。
接下来，将本发明由实施例详细地说明，但本发明不限定于这些实施例。
【实施例】
【实施例1：骨髓纤维化的状态的判断】
1.试剂
(1-1)试样稀释用缓冲液(第1试剂)
调制含10mmhepes(ph7.5)的缓冲液，作为第1试剂使用。
(1-2)固定wfa凝集素的磁性粒子(第2试剂)
如下所述调制含固定wfa凝集素的磁性粒子的悬浮液，作为第2试剂使用。
(1-2-1)生物素化2聚体wfa凝集素的调制
将wfa凝集素(vectorlaboratories公司制，商品名：wisteriafloribundalectin)添加到20mm磷酸缓冲液(ph7.5)中，得到含有wfa的溶液(wfa浓度2.5mg/ml)。向得到的含有wfa的溶液添加作为含生物素的交联剂的5-(n-琥珀酰亚胺基氧基羰基)戊基d-生物素酰胺(株式会社同仁化学研究所制。商品名：biotin-ac5-osu)至wfa/交联剂(摩尔比)成为1/100。通过将得到的溶液于25℃温育90分钟，使wfa凝集素和含生物素的交联剂反应，得到反应产物。将得到的反应产物由高效液相层析(hplc)纯化，得到生物素化2聚体wfa凝集素。在hplc中，作为溶出溶剂使用磷酸缓冲液(ph6.5)，作为分离柱使用凝胶过滤柱(thor株式会社制。商品名：tskgelg3000swxl)。再者，由于当生物素化的4聚体wfa凝集素的分子量的理论值是116000时，得到的反应产物的由hplc的预计分子量是56000，从而得知该反应产物是生物素化2聚体wfa凝集素。
(1-2-2)含有链霉亲和素结合粒子的液的调制的调制
将在表面固定了链霉亲和素的磁性粒子(平均粒径2μm，磁性粒子每1g的链霉亲和素的量是2.9～3.5mg，以下也称为“sta结合磁性粒子”)用10mmhepes缓冲液(ph7.5)清洗3次。将清洗后的sta结合磁性粒子添加到10mmhepes缓冲液(ph7.5)中，至链霉亲和素浓度成为18～22μg/ml(sta结合磁性粒子的浓度是0.48～0.52mg/ml)而得到含有sta结合磁性粒子的液。
(1-2-3)固定2聚体wfa凝集素的磁性粒子的调制
将上述的生物素化2聚体wfa凝集素和含有sta结合磁性粒子的液混合至生物素化2聚体wfa凝集素的浓度成为20μg/ml而使发生反应。将得到的产物用100mmmes缓冲液(ph6.5)清洗3次，得到固定2聚体wfa凝集素的磁性粒子(以下，也称为“2聚体wfa固定化粒子”)。将得到的2聚体wfa固定化载体悬浮于10mmhepes缓冲液(ph7.5)而得到含2聚体wfa固定化粒子的悬浮液(粒子浓度0.5w/v％)。
(1-3)含标记抗m2bp抗体的溶液(第3试剂)
作为标记抗m2bp抗体，使用碱性磷酸酶标记抗m2bp单克隆抗体(以下，也称为“alp标记抗m2bp抗体”)。调制含alp标记抗m2bp抗体及10mmhepes(ph7.5)的溶液(抗体浓度0.1u/ml)而作为第3试剂使用。
(1-4)测定用缓冲液(第4试剂)
以hisclr4试剂(sysmex株式会社制)作为第4试剂使用。
(1-5)底物(第5试剂)
以作为碱性磷酸酶的化学发光底物使用cdp-star(注册商标)(appliedbiosystems公司)的hisclr5试剂(sysmex株式会社制)作为第5试剂使用。
2.骨髓纤维化的状态的判断
(2-1)对象患者
以在名古屋市立大学医院诊断的真性多血症(pv)、原发性血小板血症(et)及原发性骨髓纤维症(pmf)的患者作为对象，回顾性地解析骨髓纤维化和wfa+-m2bp值的关联。hbs抗原阳性或hcv抗体阳性例除外。与wfa+-m2bp的测定值的信息独立地确定各患者的骨髓纤维化的状态。具体而言，基于“europeanconsensusongradingofbonemarrowfibrosis”，由血液病理医评价骨髓活体检查标本，分类为mf-0～mf-3。本研究受当院irb承认审查。
(2-2)有与wfa凝集素结合的糖链的m2bp的测定
作为血液试样，使用上述的患者的保存血清。使用上述的第1～第5试剂而由全自动免疫测定装置hiscl2000i(sysmex株式会社制)测定wfa+-m2bp。再者，在实施例1中，作为wfa+-m2bp的测定值，使用从患者的血液试样、hisclm2bpginc(sysmex株式会社制，以下称为“nc试样”)及hisclm2bpgipc(sysmex株式会社制，以下称为“pc试样”)的信号强度算出的值。此测定值根据以下的计算式而由hiscl2000i自动算出。
wfa+-m2bp测定值＝[(患者的血液试样的信号强度)-(nc试样的信号强度)]/[(pc试样的信号强度)-(nc试样的信号强度)]
使用mann-whitneyu检验，在骨髓活体检查中分类的mf-0/1组和mf-2/3组之间比较wfa+-m2bp的测定值。从roc曲线确定wfa+-m2bp的截止值，算出灵敏度、特异性、阳性的中率及阴性的中率。在数据解析中使用spss统计软件(imb公司制)，在p值不足0.05时判断为统计学显著。mf-0/1组及mf-2/3组的各自的wfa+-m2bp的测定值示于图1，mf-0～mf-3的各组的wfa+-m2bp的测定值示于图3。另外，上述的roc曲线示于图2。
3.结果
全40例的患者背景示于表1及2。表1是将患者分类为mf-0/1及mf-2/3的2组的表，表2是将患者分类为mf-0～mf-3的4组的表。再者，在表1及2中记载的wfa+-m2bp的测定值是各组的中位值。疾病的明细是：pv是10例(25％)、et是27例(68％)、pmf是3例(8％)，二次性骨髓纤维症是：post-pvmf是1例、post-etmf是4例。男性是20名，女性是20名。年龄中位值是72岁(范围：28～89岁)。jak2v617f变异用26例(65％)检测。用ct确认脾肿大的病例是19例(48％)。仅无治疗经过观察的病例(含抗血小板药治疗)是14例、羟基脲(hu)内服中的病例是23例、使用jak抑制药的病例是3例。在由骨髓活体检查的评价中，mf-0是3例(8％)、mf-1是25例(63％)、mf-2是10例(25％)、mf-3是2例(5％)。全40例的wfa+-m2bp的测定值的中位值是0.86(范围：0.25-3.18)。
【表1】
【表2】
对mf-0/1组和mf-2/3组的患者背景进行比较，则在mf-2/3组的方更多确认pmf、二次性mf、脾肿大、在末梢血中的母细胞及成红细胞的出现、贫血、及乳酸脱氢酶(ldh)升高(参照表1)。另外，当对wfa+-m2bp的测定值进行比较时，与mf-0/1组比，在mf-2/3组的方显著地高(p＝0.030)。由roc曲线求出的wfa+-m2bp的测定值的截止值是1.24(参照图2)。当使用此wfa+-m2bp的测定值的截止值而判断各患者的骨髓纤维化的状态是否相当于mf-2/3时，灵敏度是58.3％、特异性是82.1％、阳性的中率是58.3％、阴性的中率是82.1％。从而显示，mf患者的末梢血中所含的wfa+-m2bp成为用于判断骨髓纤维化的状态的标志物的可能性。
【实施例2：骨髓纤维症的治疗效果的监测】
1.材料
(1-1)试剂及测定装置
作为用于测定血清中的wfa+-m2bp的试剂，使用与实施例1相同的第1～第5试剂。作为测定装置，使用全自动免疫测定装置hiscl2000i(sysmex株式会社制)。
(1-2)治疗药
在mf的治疗中，使用作为骨髓纤维症的治疗药(jak抑制剂)的鲁索替尼(novartispharma株式会社制，制剂名：jakavi(注册商标)锭)。施用量根据所述制剂的附带文书，根据患者的状态确定。
2.治疗效果的监测
以骨髓纤维症的患者2例(72岁男性及66岁女性)作为对象。患者的主要诉说症状是伴随著明的脾肿大的腹部胀满。在jak抑制剂的施用前，从各患者采集末梢血，与实施例1同样，对血清中的wfa+-m2bp进行测定。向患者施用治疗药4个月或6个月。结果，患者的脾脏缩小，随伴症状改善。在此时点，从各患者采集末梢血，对血清中的wfa+-m2bp进行测定。结果示于图4。图中，病例1显示施用治疗药6个月的患者，病例2显示施用治疗药4个月的患者。
3.结果
如图4所示，在病例1及2中，确认到治疗药施用后的血清中wfa+-m2bp的测定值与施用前比降低。特别是，对于病例1，在治疗药的施用前骨髓纤维化的状态是mf-2/3，wfa+-m2bp测定值也是高达1.96的值，但治疗药的施用后确认到改善至作为相当于mf-0/1的wfa+-m2bp测定值的0.68。病例1及2中脾肿大等的随伴症状均改善。由于在短期间内难以进行侵袭性高的骨髓活体检查，未病理组织学地确认纤维化的改善，是少数例的探讨，无法否定选择偏倚的可能性，但认为提示了这2个病例的临床经过基于wfa+-m2bp的测定值而判断对于骨髓纤维症的治疗的效果的可能性。
【实施例3：骨髓纤维症的治疗效果的监测(2)】
1.材料
(1-1)试剂及测定装置
作为用于测定血清中的wfa+-m2bp的试剂，使用与实施例1相同的第1～第5试剂。作为测定装置，使用全自动免疫测定装置hiscl2000i(sysmex株式会社制)。
(1-2)治疗药
与实施例2同样地，在mf的治疗中，使用作为骨髓纤维症的治疗药(jak抑制剂)的鲁索替尼(novartispharma株式会社制，制剂名：jakavi(注册商标)锭)。施用量根据所述制剂的附带文书，根据患者的状态确定。
2.治疗效果的监测
以作为与实施例2的患者不同的患者的骨髓纤维症患者3例(患者a：74岁男性、患者b：81岁男性、及患者c：68岁女性)作为对象。患者的主要诉说症状是伴随著明的脾肿大的腹部胀满。在治疗药的施用前，从各患者采集末梢血，与实施例1同样地对血清中的wfa+-m2bp进行测定。对于患者a，将治疗药的施用在2014年7月23日开始，在至2016年6月2日期间定期采集末梢血，对血清中的wfa+-m2bp进行测定。对于患者b，将治疗药的施用在2014年11月18日开始，在至2016年4月1日期间定期采集末梢血，对血清中的wfa+-m2bp进行测定。对于患者c，将治疗药的施用在2015年2月16日开始，在至2016年5月1日期间定期采集末梢血，对血清中的wfa+-m2bp进行测定。另外，由观察结果确认治疗药的施用后患者的巨脾症(splenomegaly)改善与否。wfa+-m2bp的测定结果示于图10a～c。
对于患者a及c，在治疗药的施用前后进行骨髓活体检查，确认纤维化改善与否。具体而言如下。在治疗药的施用前及30个月施用后从患者a采集骨髓。另外，在治疗药的施用前及19个月施用后从患者c采集骨髓。对于采集的骨髓，根据常规方法进行苏木精染色、银染色及马森三色染色。对得到的病理组织标本进行观察，评价骨髓的纤维化。染色的骨髓的显微镜照片示于图11a及b。
3.结果
如图10a～c所示，在全患者中确认到，与施用前比，血清中wfa+-m2bp的测定值因治疗药的继续施用而降低。另外，由观察结果确认，在全部患者中，治疗药的施用后巨脾症改善。即，治疗药的施用导致的血清中wfa+-m2bp的测定值的降低与巨脾症改善的观察结果一致。如图11a所示，患者a的髓纤维症的状态在治疗药的施用前是mf-3，但在治疗药的施用后改善至相当于mf-2。另外，如图11b所示，患者c的髓纤维症的状态在治疗药的施用前是mf-2，但在治疗药的施用后改善至mf-1。从而，治疗药的施用导致的血清中wfa+-m2bp的测定值的降低与骨髓活体检查的结果一致。这些表明，血清中wfa+-m2bp的测定值成为用于治疗药施用导致的骨髓纤维症的治疗效果的监测的客观的指标。
【符号的说明】
10：诊断装置
20：免疫测定装置
30：计算机系统
40：记录介质
300：计算机本体
301：输入部
302：显示部
310：cpu
311：rom
312：ram
313：硬盘
314：输入输出接口
315：读取装置
316：通信接口
317：图像输出接口
318：总线