基于功能化金纳米粒子的新型比色传感器检测毒死蜱的制作方法

基于功能化金纳米粒子的新型比色传感器检测毒死蜱的方法，属于分析化学技术领域。

背景技术：

毒死蜱是1965年美国陶氏化学公司研制成功的一种高效光谱杀虫剂，商品名称是乐斯本，它属于杂环类有机磷农药，40年来已成为一种最大吨位的有机磷农药。现在已经被广泛应用于防治水稻、麦类、蔬菜、花卉等作物的害虫。毒死蜱是一种高效、中毒、广谱性有机磷杀虫剂，它的毒性不是很强，但对人体的皮肤有强烈的刺激作用，进入眼中对眼睛也有一定的损伤。少量毒死蜱在高等动物体内可以快速降解为无毒物质。从作用特性上看毒死蜱是属于神经性毒剂，它的杀毒机制是通过抑制生物体内的神经突触AchE的活性，从而导致大量的AchE沉积下来，中断神经传导，最终可以导致神经麻痹，严重时还可导致死亡。

目前，国内外关于毒死蜱的检测方法主要有：气相色谱法、酶联免疫法，以及分子印迹技术。

气相色谱法能满足分析要求，但所用仪器通常较为昂贵且复杂，对操作人员的仪器操作技能要求比较高，与此同时样品准备耗时长、成本高；酶联免疫法虽然较为快速简单，但抗干扰能力差，对结构类似的化合物可能存在假阳性误差，而且抗体的制备难度大，成本高；分子印迹技术虽然灵敏度高，反应速度快，选择性好，设备简单，但是它对反应条件要求苛刻，所以这项技术仍然处于实验室阶段，并没有广泛应用于实际检测中。因此十分有必要进一步研究灵敏简便、易于操作、选择性高且适用于实际样品快速检测的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是基于功能化金纳米粒子的新型比色传感器检测毒死蜱，利用核酸适体的特异性识别及其与金纳米粒子静电吸附作用的优势，从而提供一种快速检测毒死蜱的方法，达到快速、简单、灵敏的检测毒死蜱的残留量。

技术问题：基于功能化金纳米粒子的新型比色传感器检测毒死蜱的方法主要为下述原理：

巯基乙胺修饰的金纳米粒子(AuNPs)带正电性，适配体具有带负电的磷酸骨架。分散的金纳米粒子溶液呈现酒红色，当一定量的适配体加入到带正电的金纳米粒子溶液中，由于静电吸附作用，导致金纳米粒子发生团聚，溶液颜色由酒红色变为蓝紫色。当毒死蜱与毒死蜱适配体结合后就会形成适配体复合体，引起适配体的构型发生变化，破坏适配体与金纳米粒子之间的静电吸附作用，金纳米粒子不发生团聚，颜色不改变。据此，可以对毒死蜱进行定量检测。

本发明的技术方案：

包括以下步骤：巯基乙胺修饰的金纳米粒子的合成；通过测定紫外可见吸收光谱观察金纳米粒子、核酸适配体和目标物毒死蜱体系的反应；利用目标物与适配体的特异性结合检测毒死蜱并进行实际样品的检测。

(1)巯基乙胺修饰的金纳米粒子的合成

在避光的条件下，将400μL巯基乙胺盐酸盐(0.213M)和40mL氯金酸(1.40mM)加入到100mL圆底烧瓶中，在磁力搅拌器上搅拌20min，注意避光，然后边搅拌边迅速加入新配置的NaBH₄溶液10mL(10mM)，继续搅拌30min，最终制得酒红色溶液，将所得溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液装入棕色试剂瓶中，在4℃的冰箱中保存，备用。

(2)适配体金纳米粒子比色检测毒死蜱方法建立

向1.5mL离心管中加入20μL毒死蜱适配体(2nM)然后分别加入1μg/mL不同体积的毒死蜱标准溶液，加入蒸馏水稀释至500μL体系，使得毒死蜱的终浓度分别为1,5,10,20,40,60ng/mL。漩涡混合8min后，再加入60μL金纳米粒子(终浓度为0.077nM)，震荡均匀，反应10min，观察所得到溶液的颜色，并用紫外分光光度计测定溶液的紫外可见吸收光谱，所有实验均在室温下进行。

(3)利用目标物与适配体的特异性结合检测毒死蜱

向含有60μL AuNPs和2nM核酸适配体的混合体系中，分别加入不同浓度的毒死蜱标准溶液，室温条件下反应8min后，测定该体系的紫外可见吸收光谱，AuNPs在535nm处的吸收值(A₅₃₅)将随着毒死蜱浓度的不同而发生变化。分别以毒死蜱的浓度与A₅₃₅为横纵坐标建立标准曲线。

所用的毒死蜱的终浓度依次为：1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL。本发明中，毒死蜱的检出限为0.83ng/mL，线性范围为1-110ng/mL。

(4)选择性实验的测定：

取7个1.5mL的离心管，编号为a～g，分别依次加入，a～g管(60μL AuNPs、2nM核酸适配体和70ng/mL待测物质，待测物质依次有机磷农药甲胺磷、氨基甲酸酯灭多威、拟除虫菊酯溴氰菊酯和四种结构类似物啶虫脒、阿特拉津、吡虫啉、2,4-D丁酯)，测定体系在400～800nm范围内的紫外可见吸收光谱。

(5)实际样品的检测：取苹果进行实际样品的检测

称取试样10g(精确到0.01g)于20mL离心管中，加6g无水硫酸钠和30mL乙酸乙酯，均质2min，在5000r/min离心5min，上清液过滤于250mL容量瓶中，残渣加入30mL乙酸乙酯再提取一次，过滤，合并滤液于250mL容量瓶中，备用。如权利要求4所述的方法，加入不同浓度的毒死蜱标准溶液进行测定。

本发明的有益效果：

本发明建立了基于功能化金纳米粒子的新型比色传感器检测毒死蜱的方法，该方法简单、快速、灵敏，能够快速检测毒死蜱，为今后的监管提供了方便。

附图说明

图1不同体系的紫外可见吸收光谱：a AuNPs；b AuNPs和毒死蜱适配体；c AuNPs、毒死蜱、毒死蜱适配体；d AuNPs和毒死蜱

图2不同浓度的毒死蜱(1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL)存在时金纳米粒子的紫外可见吸收光谱，插图为相应的标准曲线

图3体系中加入不同的检测物后A₅₃₅的变化：a～g管(60μL AuNPs、2nM核酸适配体和70ng/mL待测物质，待测物质依次有机磷农药甲胺磷、氨基甲酸酯灭多威、拟除虫菊酯溴氰菊酯和四种结构类似物啶虫脒、阿特拉津、吡虫啉、2,4-D丁酯)

图4金纳米粒子与含有不同浓度的毒死蜱标准液1、5、10、30、50、70、100、150、200、250ng/mg的苹果提取液体系的紫外可见吸收光谱和工作曲线图。

具体实施方式

巯基乙胺修饰的金纳米粒子的合成

材料/试剂：四水合氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O)硼氢化钠(NaBH₄)巯基乙胺盐酸盐(CS)购于上海国药控股化学试剂有限公司

方法：实验所需的所有玻璃器皿用王水浸泡24h，用蒸馏水冲洗，并浸泡24h，烘干备用。巯基乙胺修饰的金纳米粒子合成步骤具体如下：在避光的条件下，将400μL巯基乙胺盐酸盐(0.213M)和40mL氯金酸(1.40mM)加入到100mL圆底烧瓶中，在磁力搅拌器上搅拌20min，注意避光，然后边搅拌边迅速加入新配置的NaBH4溶液10mL(10mM)，继续搅拌30min，最终制得酒红色溶液，将所得溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液装入棕色试剂瓶中，在4℃的冰箱中保存，备用。

结果：得到酒红色的巯基乙胺修饰的金纳米粒子溶液

由于金纳米粒子溶液的体积会对实验体系产生一定的影响，因此需要研究金纳米粒子的体积的作用效果。

材料/试剂：金纳米粒子溶液：自己根据文献合成

方法：取6个1.5mL的离心管，标号为a～f，向每个管中加入2nM的毒死蜱适配体，然后再分别加入：40、50、60、70、80、90μL金纳米粒子溶液，反应完全后，测定上述溶液的紫外可见吸收光谱，计算A₅₃₅的下降值。

结果：随着金纳米粒子溶液浓度的增加，A₅₃₅的下降值会先增大后降低，当加入金纳米粒子溶液体积为60μL时，该值达到最大，实验现象最明显，因此，金纳米粒子溶液的最佳体积为60μL。

除此之外，核酸适配体的浓度也会对实验体系产生一定的影响，因此需要研究适配体浓度的作用效果。材料/试剂：毒死蜱核酸适配体：由生工生物(上海)试剂公司合成

方法：取6个1.5mL的离心管，标号为a～f，向每个管中加入60μL金纳米粒子溶液，然后再分别加入：0.2、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0nM毒死蜱适配体，加水补齐至500μL，反应一定时间后，测定上述溶液的紫外可见吸收光谱，同时，在另一组离心管中，加入50μL 1μg/mL毒死蜱标准液(终浓度100ng/mL)，向其中加入与上一组相同体积的毒死蜱适配体，涡旋一定时间使其充分结合，再加入60μL金纳米粒子溶液并加水补齐至500μL，反应一定时间后，测定紫外可见吸收光谱，将两次得到的A₅₃₅做差值。

结果：毒死蜱适配体浓度在2nM以下时，差值逐渐增大，并在2nM时达到峰值，当浓度大于2nM时，差值依然比较大，不过由于适配体浓度过高会影响实验的灵敏度，因此，适配体的终浓度选为2nM。

除此之外，金纳米粒子与毒死蜱适配体反应时间也会对实验产生作用效果，因此需要对其反应时间进行优化。

材料/试剂：金纳米粒子溶液：自己根据文献合成；毒死蜱核酸适配体：由生工生物(上海)试剂公司合成方法：取一组1.5mL离心管中分别加入60μL金纳米粒子溶液和20μL 50nM毒死蜱适配体，加水补至500μL体系，分别反应不同的时间(1-8min)后，测定其紫外可见吸收光谱。

结果：分析可知，金纳米粒子与毒死蜱适配体最佳反应时间为7min。

除此之外，毒死蜱和毒死蜱适配体反应时间也会对实验产生作用效果，因此需要对其反应时间进行优化。

材料/试剂：金纳米粒子溶液：自己根据文献合成；毒死蜱核酸适配体：由生工生物(上海)试剂公司合成；毒死蜱：购买于西格玛奥德里奇试剂公司

方法：取一组1.5mL离心管，分别加入20μL毒死蜱适配体，50μL毒死蜱标准溶液，每个离心管涡旋混合不同的时间(1-10min)，分别加入金纳米粒子溶液60μL，并用水补齐至500μL体系，反应7min后测定其紫外可见吸收光谱。

结果：分析可知，毒死蜱与毒死蜱适配体的最佳反应时间为8min。

该方法用于毒死蜱检测：

材料/试剂：金纳米粒子溶液：自己根据文献合成；毒死蜱核酸适配体：由生工生物(上海)试剂公司合成；毒死蜱购自西格玛奥德里奇试剂公司；苹果购自于当地菜市场

方法：

(1)利用适配体金纳米粒子比色法检测毒死蜱：向含有60μL金纳米粒子溶液,2nM核酸适配体的混合体系中，分别加入不同浓度的毒死蜱标准溶液，室温条件下反应8min后，测定该体系的紫外可见吸收光谱，金纳米粒子在535nm处的吸光度值将随着毒死蜱浓度的不同而发生变化。

(2)所用的毒死蜱标准品浓度依次为：1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL，通过测定金纳米粒子在535nm处的吸光度值A₅₃₅，根据A₅₃₅与毒死蜱的浓度建立标准曲线。

(3)实际样品的检测：取苹果进行实际样品的检测

称取试样10g(精确到0.01g)于20mL离心管中，加6g无水硫酸钠和30mL乙酸乙酯，均质2min，在5000r/min离心5min，上清液过滤于250mL容量瓶中，残渣加入30mL乙酸乙酯再提取一次，过滤，合并滤液于250mL容量瓶中，备用。如权利要求4所述的方法，加入不同浓度的毒死蜱标准溶液进行测定。

(4)实验体系的验证：

选择性实验：

取8个1.5mL的离心管，编号为a～h，分别依次加入，a～h管(60μL金纳米粒子溶液,2nM核酸适配体,70ng/mL待测物质,待测物质依次为有机磷农药甲胺磷、氨基甲酸酯灭多威、拟除虫菊酯溴氰菊酯和四种结构类似物啶虫脒、阿特拉津、吡虫啉、2,4-D丁酯和毒死蜱),测定上述溶液的在535nm处的吸光度值A₅₃₅。

结果：分别以毒死蜱的浓度和A₅₃₅为横纵坐标建立标准曲线，计算检出限为0.83ng/mL，线性范围为1-110ng/mL。

本实验方法检测毒死蜱的加标回收试验结果见下表

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> 基于功能化金纳米粒子的新型比色传感器检测毒死蜱

<160> 1

<210> 1

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctgccacgt ccgcaagctt agggttacgc ctgcagcgat tcttgatcgc gctgctggta

atccttcttt aagcttggca cccgcatcgt 90