一种金纳米粒子探针及其制备方法和应用、检测PSA的方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种金纳米粒子探针及其制备方法和应用、检测PSA的方法。

背景技术：

蛋白质是一类最重要的生物大分子，在生物体内占有特殊地位。蛋白质是细胞中的主要功能分子，在细胞中发挥多种多样的功能，涵盖了细胞生命活动的各个方面。一些与癌症相关的疾病标志物主要成分是蛋白质，可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。例如肿瘤标志物前列腺特异抗原是由前列腺腺泡和导管的上皮细胞分泌的一种单链糖蛋白。

前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)是一种由前列腺上皮细胞内浆小泡产生、含有237个氨基酸残基的单链糖蛋白。前列腺癌患者血清游离PSA及总PSA值均明显升高，PSA对于前列腺癌的早期诊断、临床分期、术后疗效观察及随访具有重要的临床意义。

现有技术中，通常采用质谱法、核磁共振波谱法、蛋白质芯片检测分析PSA。但是这些方法有其自身的缺点，如仪器昂贵，前处理过程复杂，对蛋白质样品上样量要求高等，限制了其在多重和超灵敏检测方面的应用。蛋白质组学的迅速发展亟需新的更有效的检测方法，寻找高分辨率、高灵敏度的检测技术是蛋白质组学迅速发展的保证。临床上，快速检测微量蛋白质如血清中肿瘤标志物的含量对于疾病的准确诊断具有重要的辅助作用。因此，开发新的、简便的微量蛋白质的检测方法具有重要的实际意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种制备金纳米粒子探针的方法，根据此方法制备的金纳米粒子探针，可以检测微量PSA蛋白。

本发明的目的之二在于提供一种由上述方法制备的金纳米粒子探针，该金纳米粒子探针具有良好的光散射性质，利用此性质可以检测微量PSA蛋白。

本发明的目的之三在于提供一种上述金纳米粒子探针在检测PSA蛋白中的应用，应用该金纳米粒子探针检测微量PSA蛋白具有选择性高、灵敏度高的特点。

本发明的目的之四在于提供一种检测PSA蛋白的方法，应用该方法检测微量PSA蛋白具有选择性高、灵敏度高、简便易行的特点。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种制备金纳米粒子探针的方法，其包括：向金纳米粒子溶液中加入PSA核酸适配体，PSA核酸适配体修饰有用于连接金纳米粒子的连接体，PSA核酸适配体的碱基续列如SEQ ID NO.1所示，经搅拌、静置、离心后，取沉淀，用缓冲溶液分散沉淀，得到金纳米粒子探针溶液。

一种金纳米粒子探针，其由上述的制备金纳米粒子探针的方法制备而成。

上述金纳米粒子探针在检测PSA中的应用。

一种检测PSA的方法，其包括：

取含有金纳米粒子探针的第一溶液，检测第一溶液的散射光强度，记为I₀；

向第一溶液中加入待测样本，形成检测体系，检测上述检测体系的散射光强度，记为I₁；

根据I₁与I₀之间的差值，计算出待测样本的中的PSA浓度。

本发明实施例的一种金纳米粒子探针及其制备方法和应用、检测PSA的方法的有益效果是：本发明提供的制备金纳米粒子的制备方法制备的金纳米粒子探针具有良好的光散射性质。该金纳米粒子探针修饰有PSA核酸适配体，该适配体能特异性结合PSA，引起金纳米粒子探针发生聚集，光散射强度增加，从而检测PSA含量。利用本发明提供的金纳米粒子探针及方法检测PSA具有选择性高、灵敏度高、简便易行的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1制得的金纳米粒子的TEM图；

图2-A本发明实施例6中加入PSA前后金纳米粒子探针溶液变化图；

图2-B为本发明实施例6中加入PSA前后金纳米粒子探针的紫外-可见吸收光谱变化曲线图；

图3为本发明实施例6中加入PSA后金纳米粒子探针的TEM图；

图4为本发明实施例7中检测体系中氯化钠浓度的优化图；

图5为本发明实施例8中检测体系pH的优化图；

图6为本发明实施例9中加入不同浓度的PSA后金纳米粒子探针的散射光谱变化曲线图；

图7为本发明实施例9中金纳米粒子探针检测PSA的标准曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种金纳米粒子探针及其制备方法与在检测PSA中的应用及检测PSA的方法进行具体说明。

一种制备金纳米粒子探针分方法，其包括：

向金纳米粒子溶液中加入PSA核酸适配体，PSA核酸适配体修饰有用于连接金纳米粒子的连接体，PSA核酸适配体的碱基续列如SEQ ID NO.1所示，经搅拌、静置、离心后，取沉淀，用缓冲溶液分散沉淀，得到金纳米粒子探针。

金纳米粒子即为直径为纳米级别的金颗粒，被广泛用于免疫学检测的标记物或是生物探针。金纳米粒子具有良好的光散射性质，其散射光强度随金纳米粒子的粒径增大而增大。

核酸适配体(Aptamer)是一段DNA(脱氧核糖核酸)，RNA(核糖核酸)序列，XNA(核酸类似物)或肽。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。与传统的抗原-抗体反应相比，适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容易，稳定性更好。

PSA核酸适配体是一段单链DNA，其碱基序列为：

5’-AATTAAAGCTCGCCATCAAATAGC-3’(SEQ ID NO.1)。

PSA核酸适配体能特异性识别PSA，高选择性地与PSA结合。本发明将金纳米粒子与PSA核酸适配体联合用于检测PSA，其检测原理是：将金纳米粒子表面修饰上PSA核酸适配体，形成金纳米粒子探针。PSA核酸适配体特异性地结合PSA，使得金纳米粒子探针聚集，粒径增大，从而使金纳米粒子探针的散射光强度增大，PSA在一定浓度范围内，金纳米粒子探针的散射光强度增大值与PSA浓度呈线性关系。但是PSA核酸适配体与金纳米粒子之间没有亲和性，不能直接连接，所以，需要一个连接体将二者连接。

本发明中使用的PSA核酸适配体直接修饰有连接体。需要说明的是，连接体可以未修饰于PSA核酸适配体，在制备之前，先将连接体修饰于PSA核酸适配体再行制备过程。

优选地，该连接体为聚腺嘌呤。

本发明中，聚腺嘌呤修饰的PSA核酸适配体由人工合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)。聚腺嘌呤为腺嘌呤的聚合物，腺嘌呤为构成DNA的原料。聚腺嘌呤通过碱基间的亲和力与PSA核酸适配体连接。聚腺嘌呤与金纳米粒子间具有高度亲和力，因此，聚腺嘌呤可以将PSA核酸适配体与金纳米粒子连接。

优选地，聚腺嘌呤的聚合度为10-15。

聚腺嘌呤的聚合度为10-15，即聚腺嘌呤由10-15个腺嘌呤聚合而成。本发明中的聚腺嘌呤为线性聚合。修饰有聚腺嘌呤(聚合度为15)的PSA核酸适配体的结构为：

AAAAAAAAAAAAAAA-5’-AATTAAAGCTCGCCATCAAATA GC-3’。

优选地，上述搅拌为：室温下，避光磁力搅拌24-48h。

磁力搅拌是为了让金纳米粒子与连接有聚腺嘌呤的PSA核酸适配体有均等的结合机会。

优选地，上述静置时间为24-48h。

静置的目的是让金纳米粒子与连接有聚腺嘌呤的PSA核酸适配体之间形成稳定连接。

优选地，上述离心为在10000-15000r/min下，离心20-40min。

优选地，所用缓冲液为10mM磷酸缓冲溶液，pH 7.0-7.4。

一种由上述方法制备的金纳米粒子探针。

本发明提供的金纳米粒子探针，表面修饰有PSA核酸适配体，并且PSA核酸适配体与金纳米粒子之间通过聚腺嘌呤连接。本发明提供的金纳米粒子探针同时具备金纳米粒子的光散射性质以及PSA核酸适配体高度亲和及识别PSA的性质，可用于检测微量PSA。

一种检测PSA的方法，其包括：

取含有金纳米粒子探针的第一溶液，检测第一溶液的散射光强度，记为I₀。

向第一溶液中加入待测样本，形成检测体系，检测上述检测体系的散射光强度，记为I₁。

同时，向一系列含有金纳米粒子探针的第一溶液中加入不同浓度的PSA标准液制作标准曲线。

根据I₁与I₀之间的差值，计算出待测样本的中的PSA浓度。

具体地，根据加入不同浓度的PSA前后散射光强度的变化值(I₁-I₀)，计算金纳米粒子探针散射光强度的变化值与PSA浓度的关系。以PSA浓度为横坐标，金纳米粒子探针散射光强度的变化值为纵坐标，进行线性拟合。

优选地，在检测第一溶液的散射光强度之前，往第一溶液中加入氯化钠至氯化钠的浓度为18-30mM。

优选地，调节检测体系的pH为6.5-7.5。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种金纳米粒子及其制备方法，其包括：

S1：配制100mL 0.01％氯金酸溶液，放置于烧瓶中，并将烧瓶置于油浴锅中，加热至煮沸，保持5分钟以上。

S2：取3.5mL新鲜配制的质量百分数为1％的柠檬酸钠溶液，将其快速加入到煮沸的氯金酸溶液中，继续加热搅拌，使之反应完全，得到澄清透明的酒红色溶液。

S3：将酒红色溶液在13000r/min条件下，离心30分钟，弃上清液，用超纯水分散，继续离心，一共离心三次。弃去上清，用100mL超纯水分散，得到纯净的金纳米粒子溶液。

S4：将制备出的金纳米粒子溶液放置于经王水浸泡过的容量瓶中，避光放置在冰箱4℃中冷藏备用。

用透射电子显微镜(TEM)对上述方法制备得到的金纳米粒子进行表征，结果如图1(箭头所指为金纳米粒子)所示。所制备的金纳米粒子分散均匀，粒径均一，平均粒径为16nm。

取3mL金纳米粒子溶液于两通比色皿中，在波长为200-700nm范围内扫描并记录紫外-可见光光谱。实验测得金纳米粒子的紫外-可见光光谱，在520nm波长处有最大吸收。

实施例2

本实施例提供一种金纳米粒子探针的制备方法，其包括：

S1：将100μL(10μM)修饰有聚腺嘌呤(聚合度为15)的PSA核酸适配体加入到4mL上述金纳米粒子溶液中，室温避光搅拌使之反应48小时后停止搅拌，静置稳定24小时，得到粗溶液。

S2：将合成出的粗溶液在15000r/min条件下，离心40min。用磷酸缓冲溶液(10mM,pH 7.0)洗涤分散，除去游离的PSA核酸适配体，重复离心三次，最后用磷酸缓冲溶液分散，得到金纳米粒子探针的溶液，将金纳米粒子探针溶液放入4℃中静置待用。

实施例3

本实施例提供一种金纳米粒子探针的制备方法，其包括：

S1：将100μL(10μM)修饰有聚腺嘌呤(聚合度为13)的PSA核酸适配体加入到4mL上述金纳米粒子溶液中，室温避光搅拌使之反应36小时后停止搅拌，静置稳定24小时，得到粗溶液。

S2：将合成出的粗溶液在13000r/min条件下，离心30min。用磷酸缓冲溶液(10mM,pH 7.2)洗涤分散，除去游离的PSA核酸适配体，重复离心三次，最后用磷酸缓冲溶液分散，得到金纳米粒子探针的溶液，将金纳米粒子探针溶液放入4℃中静置待用。

实施例4

本实施例提供一种金纳米粒子探针的制备方法，其包括：

S1：将100μL(10μM)修饰有聚腺嘌呤(聚合度为10)的PSA核酸适配体加入到4mL上述金纳米粒子溶液中，室温避光搅拌使之反应24小时后停止搅拌，静置稳定24小时，得到粗溶液。

S2：将合成出的粗溶液在10000r/min条件下，离心20min。用磷酸缓冲溶液(10mM,pH 7.4)洗涤分散，除去游离的PSA核酸适配体，重复离心三次，最后用磷酸缓冲溶液分散，得到金纳米粒子探针的溶液，将金纳米粒子探针溶液放入4℃中静置待用。

实施例5

本实施例提供一种由实施例2提供的一种金纳米粒子探针的制备方法制备的金纳米粒子探针。

本实施例提供的金纳米粒子探针，表面修饰有PSA核酸适配体，并且PSA核酸适配体与金纳米粒子之间通过聚合度为15的聚腺嘌呤连接。本发明提供的金纳米粒子探针同时具备金纳米粒子的光散射性质以及PSA核酸适配体高度亲和及识别PSA的性质，可用于检测微量PSA。

实施例6

本实施例提供实施例5提供的金纳米粒子探针检测PSA的验证实验，其包括：

S1：取金纳米粒子探针溶液，检测其在520nm处的吸收光强度。

S2：另取三分金纳米粒子探针溶液，分别加入PSA至终浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，摇匀，静置10min，分别检测加入PSA后的金纳米粒子探针溶液在520nm处的吸收光强度。

验证结果如图2所示。图2-A(a为加入PSA前，b为加入PSA后)显示，加入PSA前，金纳米粒子探针溶液为酒红色。加入PSA后，金纳米粒子探针发生聚集，溶液由酒红色变为紫色。检测金纳米粒子探针溶液在520nm处的吸收光强度，结果如图2-B所示。图2-B(1-4分别表示加入PSA前、加入PSA浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的吸收光谱)显示，加入PSA后吸收光强度降低，随着PSA浓度的增加，吸收光强度降低越明显。

将金纳米粒子射探针加入PSA(5.0ng/mL)后的样品进行电镜表征，结果如图3(箭头所指为结合PSA后聚集的金纳米粒子探针)所示。加入PSA后，金纳米粒子探针出现明显的聚集，表明金纳米粒子探针与待测物蛋白PSA发生相互作用，产生大粒径的散射粒子。

综上，本发明提供的金纳米粒子探针由表面修饰有PSA核酸适配体的金纳米粒子构成，金纳米粒子与PSA适配体之间通过聚腺嘌呤连接。金纳米粒子探针兼具金纳米粒子的光学性质与PSA核酸适配体的特异性识别及结合PSA的功能。金纳米粒子探针能识别并特异性结合PSA，引起金纳米粒子探针聚集，产生大粒径的散射粒子，引起散射光信号增强，以此检测微量PSA。

实施例7

本实施例提供金纳米粒子探针检测PSA的检测体系的离子强度的优化，其包括：

S1：取金纳米粒子探针溶液，分别加入氯化钠至终浓度为2mM、4mM、8mM、12mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、28mM、30mM形成不同检测体系，摇匀，静置5min，检测不同检测体系在422nm处的散射光强度。

S2：向不同检测体系中加入相同浓度的PSA，摇匀，静置10min，检测不同的检测体系在422nm处的散射光强度。

比较在不同氯化钠浓度下，加入PSA前后各个检测体系在422nm处的散射光强度变化值。

结果如图4所示。氯化钠浓度在2mM-30mM时，检测体系的散射光强度变化值随氯化钠浓度的增大先增大后减小，并且在20mM处散射光强度变化值最大。即当检测体系的氯化钠浓度为20mM时，金纳米粒子探针对PSA的检测最灵敏。

实施例8

本实施例提供金纳米粒子探针检测PSA的检测体系的pH的优化，其包括：

S1：取金纳米粒子探针溶液，分别加入10mM磷酸缓冲液至pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10形成不同检测体系，摇匀，静置5min，检测不同检测体系在422nm处的散射光强度。

S2：向不同检测体系中加入PSA至PSA浓度相同，摇匀，静置10min，检测不同的检测体系在422nm处的散射光强度。

比较在不同pH下，加入PSA前后各个检测体系在422nm处的散射光强度变化值。

结果如图5所示。pH5-10时，检测体系的散射光强度变化值随氯化钠浓度的增大先增大后减小，并且在pH7处散射光强度变化值最大。即当检测体系的pH为7时，金纳米粒子探针对PSA的检测最灵敏。

实施例9

本实施例提供一种金纳米粒子探针检测PSA的方法，其包括：

S1：取200μL金纳米粒子探针溶液7份，加入氯化钠至浓度为20mM，加入10mM磷酸缓冲液调节溶液pH为7形成检测体系，摇匀，静置5min，测定检测体系在422nm波长处的散射光强度，记为I₀。

S2：向各个检测体系中分别加入不同浓度(0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL)的PSA标准液以及PSA待测样品，摇匀，静置10min，测定不同检测体系在422nm波长处的散射光强度，记为I₁。

根据加入不同浓度的PSA前后散射光强度的变化值(I₁-I₀)，计算金纳米粒子探针散射光强度的变化值与PSA浓度的关系。具体地，以PSA浓度为横坐标，金纳米粒子探针散射光强度的变化值为纵坐标，进行线性拟合。

不同检测体侧的散射光光谱图如图6(1-7分别为加入的PSA浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL)所示。在0ng/mL-20ng/mL范围内，金纳米粒子探针散射光强度随PSA浓度增加而增加。

金纳米粒子探针散射光强度的变化值与PSA浓度的关系曲线如图7所示。0ng/mL-20ng/mL范围内，金纳米粒子探针散射光强度变化值与PSA浓度呈线性关系，其中，线性方程为：Y＝0.31+10.73X(R＝0.9882)。

本实施例提供的金纳米粒子探针检测PSA的方法，在0.1ng/mL-20ng/mL范围内，PSA浓度与金纳米粒子探针的散射光强度的增加值呈现良好的线性关系，其检出限为0.02ng/mL。该方法具有高选择性、高灵敏度、简便、易行等特点。

实施例10

本实施例提供金纳米粒子探针在检测实际样品中的准确性验证。即应用实施例5中提供的金纳米粒子探针联合实施例9中提供检测方法，对实际样品中的PSA进行检测，同时，利用PSA酶联免疫试剂盒对相同的样品进行检测，以确定金纳米粒子探针在检测实际样品中的准确性。其包括：

S1：将健康人血清样品(由东南大学医学院附属盐城市医院提供)离心，取上清液。采用加标法，将已知浓度(1ng/mL、5ng/mL、12ng/mL)的PSA样品加入上述上清液中，形成待测样品。

S2：应用实施例5中提供的金纳米粒子探针联合实施例9中提供检测方法(下文称本方法)对上述待测样品进行检测。

S3：按照试剂盒说明书的方法对上述待测样品进行检测。

检测结果如表1所示，表中结果均为六次平行实验检测的平均值。

表1本方法与酶联免疫吸附法检测结果比较

与表1可知，用本方法检测PSA，检测结果与酶联免疫吸附测试法检测结果一致，且回收率在90％-110％范围内，说明利用本发明提供的金纳米粒子探针及检测PSA的方法检测结果准确，能够用于临床实际样品的检测。

综上所述，本发明提供的制备金纳米粒子探针的方法制备的金纳米粒子探针具有良好的光散射性质。金纳米粒子探针表面修饰有PSA核酸适配体，其能特异性结合PSA，引起金纳米粒子探针发生聚集，光散射强度增加，从而检测PSA含量。利用本发明提供的金纳米粒子探针及方法检测PSA，在0.1-20ng/mL范围内，PSA浓度与金纳米粒子探针散射光强度的增加值呈现良好的线性关系，检出限为0.02ng/mL。检测实际样品时，其检测结果与酶联免疫吸附法检测结果一致。本发明提供的金纳米粒子探针检测PSA的方法具有选择性高、灵敏度高、简便易行的特点。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 盐城工学院

<120> 一种金纳米粒子探针及其制备方法和应用、检测PSA的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aattaaagct cgccatcaaa tagc 24