一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法与装置与流程

本发明属于显微成像领域，尤其涉及一种结合旋转全内反射显微和干涉对比显微实现对超薄细胞的高精度轴向定位和三维成像的方法与装置。

背景技术：

生物科学研究的发展使得对生物现象的观察趋向于更精确，即要求更高的分辨率。在传统的显微方法中，照明的时整个视场在在z轴方向上都被照明光束照明，z轴方向的分辨率和信噪比一直都做不高，因此需要一种仅观察超薄层样品结构的显微方法有，尤其是在一些与膜相关的生物现象的研究中。

统的一些提高z轴分辨率的技术手段包括光切片(Lightsheet)显微镜和全内反射显微镜(Tirf)。Lightsheet采用横向照明的方式，但由于衍射极限的存在横向照明的最细光束只能做到半波长量级，其z轴分辨率依然达不到仅观察细胞膜结构的要求，而且由于细胞的贴壁生长，光切片显微技术很难准确照明到相应的位置。Tirf利用全内反射产生的倏逝场沿z轴方向的衰减特性，通过改变全内反射的入射角度实现不同的衰减系数，从而在细胞与装在波片之间形成100nm厚的光场，这层光场恰好与细胞的贴壁生长时细胞膜的位置重合，实现了细胞膜的准确照明。由于激光散斑的存在会导致光场不均匀，因此产生了一种通过旋转照明均匀光场消除散斑的方法，即旋转全内反射显微镜(Ring-tirf)。

但这种方法的穿透深度最多为几百纳米，成像范围局限于细胞的下表面，无法对一个细胞进行完整成像，因此需要出现一种对细胞的上表面进行照明的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法与装置，可以利用全内反射和干涉照明方法实现对超薄细胞的高精度轴向定位与成像。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、操作方便等特点，可以很好地应用于荧光样品的检测之中。

一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法，包括以下步骤：

1)将激光器发出的激光光束进行准直；

2)对光束进行相应的偏振调制使其能够形成目标照明图案；

3)将调制后的光束通过二维扫描振镜系统和显微物镜聚焦到样品表面，实现在样品表面上的环形扫描和变角度扫描；

4)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光；

5)细胞下表面由入射角大于全内反射临界角的光全内反射产生的倏逝波照明，产生的荧光强度为：

其中θ为入射角，z为轴向深度，α为激发光的入射角，为激发光的方位角，I代表电场强度，ρ为考虑到发散角的激光光束强度的空间分布，Ω为光束的发散角，f为轴向的荧光分子强度。

考虑到有限的入射角和穿透深度，可以得到：

g＝Hf

其中g和f分别对应N个角度和N个深度的向量，H为N角度和N深度的信息组成的矩阵，与上述的算符均相关。因此可以将成像过程看做一个线性系统，通过求解逆问题的方式，从多角度图像中重建出细胞的三维荧光密度分布。

6)细胞上表面由入射角小于全内反射临界角的透射光与反射光干涉产生的图案照明，干涉产生的照明图案强度分布满足公式：

E～1+r^TE exp[iφ(H)]，

其中r^TE是与界面垂直的电场分量的菲涅尔反射系数，φ(H)是透射光与反射光之间的相位差。

与轴向位置H相关的φ(H)满足公式：

菲涅尔系数满足公式：

p₀＝n_Si cosθ_Si，p₁＝n_ox cosθ_ox，p₂＝n_b cosθ_b，

其中，λ为入射光真空中的波长，为特征矩阵M_TE的四个参数，k_i为不同材料中的波矢；n_Si，n_ox，n_b分别为硅、二氧化硅和样品中的折射率；θ_Si，θ_ox，θ_b分别为硅、二氧化硅和样品中的入射光角度；d_ox为二氧化硅膜层的厚度。

本发明中，当入射角度θ₁大于全反射角时，激发的倏逝波场沿着z轴发生指数衰减，对细胞的下表面照明激发荧光，通过改变照明角度改变衰减系数，实现z轴的差别照明和样品的三维成像。

在产生全内反射时，得到的图像为横向各位置光强轴向积分，其分布满足公式：

其中I(0,θ_i)为载玻片表面的电场强度，φ为探测器和荧光颗粒的量子效率，Q(z)和PSF(z)为光子收集效率和系统的点扩散函数，C(z)为荧光标记的细胞样品，z为离界面的轴向距离，d_p为穿透深度，θ_i为全内反射的激发角，n_i和n_t分别为盖玻片和样品的折射率。

另外，在采集荧光光强信息时，保持入射角度不变在显微物镜的后焦面上进行环形扫描，用于消除激光照明产生的散斑。

本发明还提供了一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像装置，包括光源、承载待测样品的样品台，所述光源与样品台之间依次设有：

用于准直激光源发出的光束的准直透镜；

用于将光源发出的光束改变为线偏振光的起偏器；

用于使线偏振光源变为圆偏振光的1/4波片；

用于使激发光在样品面上实现环形扫描和角度改变的二维扫描振镜系统；

用于在显微物镜后焦面上聚焦一个位置可控点的场镜；

用于反射激发光、透射荧光信号的二色镜；

用于将激发光聚焦到样品上的显微物镜；

并设有用于控制所述扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

针对细胞的下表面，所述的控制器控制二维扫描振镜系统，使激发光由入射角大于全内反射临界角的光产生的倏逝波进行照明；

针对细胞的上表面，所述的控制器控制二维扫描振镜系统，使激发光由入射角度小于全内反射临界角透射光和其被细胞上表面附近反射一次后的反射光干涉产生的图案进行照明。

本发明中通过探测系统接收样品发出的信号光，该探测系统包括：

用于将信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；

用于探测信号光的光强信号的CCD探测器。

作为优选的，所述光源与起偏器之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤和准直的准直透镜。

本发明中所述的细胞上表面附近的盖玻片表面与细胞之间依次镀了硅膜和二氧化硅膜用于增强反射效应。

作为优选的，在对细胞的上表面成像时，需要移除所述的1/4波片。

本发明原理如下：

显微系统的分辨率受光学系统衍射的影响，目前一些比较卓越的超分辨方法都是针对横向分辨率的提高，但是对于轴向分辨率的提高还是不足。Lightsheet横向照明的最细光束只能做到半波长量级，Tirf的穿透深度最多为几百纳米，成像范围局限于细胞的下表面，无法对一个细胞进行完整成像。

在本发明方法中，为了对一个超薄细胞进行完整的z轴定位和三维成像，将细胞分为了上下表面两个部分。对于细胞的下表面，利用Ring-tirf的方法实现多角度环形照明，得到的不同角度下的荧光强度与荧光颗粒的轴向位置相关。将系统成像过程看做是与角度和轴向位置相关的线性系统，通过得到的荧光强度用求解逆问题的方式算得荧光颗粒的轴向分布，得到其三维图像。这样能够得到细胞下表面以上大致800nm的三维图像。在细胞的上表面附近的盖玻片上分别镀上硅膜和二氧化硅膜，形成对入射的激发光的高反膜。入射的激发光与其反射光干涉产生的图案对细胞的上表面进行照明，干涉产生的照明图案强度分布与轴向位置相关。通过改变入射角度可以改变干涉产生的照明图案，从而得到每个轴向位置在不同角度照明时的强度变化曲线，将得到的荧光信息与曲线对应即可得到荧光颗粒的轴向分布。这样能够得到细胞上表面以下大致400nm的三维图像。将两种方法结合可以对厚度为1μm左右的超薄细胞进行高精度的轴向定位与三维成像。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)提出了通过解逆问题的方式处理得到的荧光信息进行三维成像；

(2)首次提出了结合多角度环形全内反射和干涉照明对一整个薄细胞进行轴向定位和三维成像；

(3)装置简单，操作方便。

附图说明

图1为本实施例的三维成像装置的结构示意图；

图2为本实施例中以全内反射方式对细胞下表面进行照明的示意图；

图3为本实施例中以反射干涉方式对细胞上表面进行照明的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示的超分辨显微装置，包括：激光器1，准直透镜2，起偏器3，1/4波片4，第一扫描振镜5，第一扫描透镜6，第二扫描透镜7，第二扫描振镜8，场镜9，二色镜10，显微物镜11，样品台12，聚焦透镜13和CCD探测器14。

其中，准直透镜2，起偏器3，1/4波片4依次位于激光器1出射光束的光轴之上。

其中，第一扫描振镜5，第一扫描透镜6，第二扫描透镜7，第二扫描振镜8组成了一个4f系统。

其中，场镜9位于经第二扫描振镜8反射后光束的光轴之上。

其中，显微物镜11，样品台12依次位于二色镜10反射后出射光束的光轴之上。

其中，聚焦透镜13、CCD探测器14依次位于经二色镜10后透射光束的光轴之上。

其中，控制器与第一扫描振镜5和第二扫描振镜8相连，用于控制扫描振镜系统的扫描。

上述装置中，显微物镜11的数值孔径NA＝1.49。

采用图1所示的装置进行超分辨显微的方法如下：

从激光器1发出的激光光束，经过准直透镜2完成准直。经过准直后的光束入射到起偏器3变为线偏振光，经过1/4波片4变为圆偏振光。第一扫描振镜5和第二扫描振镜8分别位于4f系统的输入和输出面上，为共轭关系。经过二维扫描振镜系统之后的平行光经过场镜、二色镜的反射和显微物镜聚焦到样品平面上。用于控制二维扫描振镜系统的控制器首先控制激发光的入射角从全内反射的临界角开始增大，使激发光在载玻片界面上发生全内反射，产生的倏逝波对细胞的下表面进行照明，如图2所示。同时在CCD探测器14的曝光时间内改变激发光的方位角保持入射角不变形成环形照明，消除散斑对结果的影响。该倏逝波激发的荧光在CCD探测器14上被探测到的强度也随z轴以指数形式衰减，可以写为：

其中θ为入射角，z为轴向深度，α为激发光的入射角，为激发光的方位角，I代表电场强度，ρ为考虑到发散角的激光光束强度的空间分布，Ω为光束的发散角，f为轴向的荧光分子强度。考虑到有限的入射角和穿透深度，我们可以得到：

g＝Hf

其中g和f分别对应N个角度和N个深度的向量，H为N角度和N深度的信息组成的矩阵，与上述的算符均相关。因此将成像过程看做一个线性系统，不同深度的荧光颗粒在多角度入射时的强度分布可以大致确定，再通过求解逆问题的方式重建出细胞下表面以上800nm左右的三维荧光密度分布。

然后控制二维扫描振镜系统使激发光的入射角从0度扫描至全内反射临界角之间，此时激发光直接入射到细胞上表面附近镀了高反膜的盖玻片上，反射一次后的反射光与直接入射光进行干涉，产生干涉图案对细胞上表面进行照明，如图3所示。改变角度同样也可以得到不同深度的荧光颗粒对应不同入射角度时被激发的荧光强度，得到细胞上表面以下400nm左右的三维荧光密度分布。结合两种照明方式得到的数据，可以对厚度在1μm左右的超薄细胞进行高精度的轴向定位与三维成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。