基于单分子荧光显微成像获取聚合物形变时的测量系统的制作方法

本发明是关于一种基于单分子荧光显微成像获取聚合物形变时的测量系统，涉及对聚合物形变机理及脆、韧性根源等探索的高分子物理基础研究领域。

背景技术：

在材料领域玻璃态聚合物得到了广泛的应用，原因除了其轻量、绝缘、易加工成型等优势外还在于其具有良好的机械性能(如工程塑料)。与其他种类高模量固体材料相比聚合物通常更有韧性，在外力作用下可以发生较大的形变而不会断裂。现在众多研究都在寻求在保持聚合物良好的可加工性能的同时进一步增强聚合物的模量和韧性，这就要求对玻璃态聚合物在外力作用下发生形变的机理有更深层次的理解。研究玻璃态聚合物的形变机理一直是高分子物理领域非常大的挑战。处于玻璃态的聚合物自身在未发生形变时就存在非常复杂的物理特性如空间的动态非均匀性和结构松弛的特性，而形变过程中还进一步表现出非线性的响应特征。对于聚合物形变时非线性响应的研究已经进行了相当长的时间。

理论方面，1936年Eyring提出外力降低分子重排势垒从而使玻璃具有流动性的观点来解释玻璃的形变(“Viscosity,Plasticity,and Diffusion as Examples of Absolute Reaction Rates”J.Chem.Phys.,1936,4,283-291.)。之后以Eyring模型为基础，提出了众多的理论模型来描述玻璃态聚合物的形变行为。

实验方面，Gleason等通过固态核磁方法研究了尼龙-6的拉伸形变过程，证明了形变时无定形区链运动能力的增强(“Chain Mobility in the Amorphous Region of Nylon 6 Observed under Active Uniaxial Deformation”Science 2000,288,(5463),116-119.)；Argon等通过小分子向聚合物基体渗透的方法研究了玻璃态聚合物形变时的链运动能力，发现聚合物在远低于其玻璃化温度下被压缩时，小分子渗入其中的速率就可以与在玻璃化温度下未发生形变时的渗透速率相当(“Enhanced Case-II diffusion of diluents into glassy polymers undergoing plastic flow”Polymer 2001,42,(2),613-621.)；Vigier等结合动态机械分析和小角X射线散射结果研究玻璃态聚合物形变时发现形变过程中聚合物内部产生许多链运动能力较强的微小区域(high mobility zones)，且区域随着形变先是尺寸增加，之后是数目的增加(“Characterization of the Drastic Increase in Molecular Mobility of a Deformed Amorphous Polymer”Phys.Rev.Lett.2006,97,(20),207801.)。

尽管经过了许多实验方法的探索，深入理解玻璃态聚合物非线性形变行为的目标仍未实现，原因之一是定量研究不足，二是缺少深入到单分子链级别的描述。Ediger等将荧光探针引入聚合物中随之用线偏振光对探针进行漂白使发射的荧光具有各向异性，之后通过跟踪计算形变过程中荧光各向异性的衰减实现了定量研究聚合物链运动的能力，所得结果具有一定普适性。遗憾的是该方法得到的是链运动的统计信息，无法用来描述分子链级别的响应。Wang等的研究以分子链为基础提出了唯象的负载链(load-bearing strands)模型来解释聚合物形变时的脆、韧性及屈服行为，但是目前为止该模型仍需更多证据支持。因此，目前亟需一种可以达到单分子级别的实验测试手段来更精细地研究玻璃态聚合物在形变过程中的链响应行为。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种基于单分子荧光显微成像获取聚合物形变时的测量系统，能够更精细地研究玻璃态聚合物在形变过程中的链响应行为。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种基于单分子荧光显微成像获取聚合物形变时的测量系统，其特征在于，该测量系统包括：一用于使得一个以上的激发光光源产生圆偏振光以激发各个方向取向的荧光探针的激发光光源单元；一用于将所述激发光光源单元发出的圆偏振光会聚到发生形变的待测样品，同时将待测样品产生的荧光信号收集并导出的光学显微单元；一用于固定设置待测样品，并对待测样品进行拉伸测试，获得待测样品应力应变数据的高精度机械拉伸单元；一用于在待测样品形变过程中进行单分子显微成像的单分子荧光成像单元。

进一步地，该测量系统还包括一计算机，所述计算机获取所述待测样品应力应变数据和单分子荧光成像结果，并将两者进行关联分析后得到待测样品形变状态下荧光探针周围分子链的运动和空间取向信息从而得到玻璃态聚合物在局部和观察区域整体的链响应信息。

进一步地，所述激发光光源单元一个以上的激发光光源、一格兰泰勒棱镜、两光阑、一1/4波片、五光学透镜、一快门、一斩波器和一中性密度滤波片；所述激发光光源发出的不同波长的激发光分别经若干反射镜反射后依次进入所述格兰泰勒棱镜起偏成为线偏振光，经所述格兰泰勒棱镜出射的线偏振光经第一光阑发射到所述1/4波片形成圆偏振光，经所述1/4波片出射的圆偏振光发射到第一光学透镜、快门和第二光学透镜，经所述第二光学透镜出射的激发光发射到所述斩波器，所述斩波器对激发光的频率进行调制后通过第二光阑发射到所述中性密度滤波片进行滤波处理，经所述中性密度滤波片出射的激发光依次进入第三光学透镜和第四光学透镜，通过调节所述第三光学透镜和第四光学透镜实现激发光于所述光学显微单元的物镜负焦平面处聚焦从而出射为平行扩束的圆偏振光，经所述第四光学透镜出射的光进入所述光学显微单元。

进一步地，所述光学显微单元采用倒置显微镜，圆偏振光经物镜聚焦待测样品，待测样品的荧光探针经圆偏振光激发产生荧光，荧光经所述物镜收集并经第五光学透镜发射到所述单分子荧光成像单元。

进一步地，所述单分子荧光成像单元采用EMCCD相机。

进一步地，所述高精度机械拉伸单元为原位单轴双向机械拉伸装置，所述高精度机械拉伸单元包括基板、伺服电机、具有双向螺纹的传动轴和样品固定/拉伸组件，所述样品固定/拉伸组件用于固定设置所述待测样品，其中，所述基板包括下层基板、中层基板和上层基板，相邻层间基板之间不直接接触而通过层间导轨间接固定，层间导轨用于X-Y面的调节从而实现在拉伸方向及垂直于拉伸方向上的位置调节，所述下层基板用于与所述光学显微单元进行固定，所述伺服电机固定连接所述双向螺纹的传动轴，所述双向螺纹的传动轴分别固定连接所述样品固定/拉伸组件，所述伺服电机通过所述计算机实现对待测样品形变的控制，所述样品固定/拉伸组件通过固定设置在所述上层基板的并行双导轨实现滑动。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明的激发光光源经格兰泰勒棱镜出射为线偏振光并经1/4波片形成圆偏振光以激发各个方向取向的荧光探针，因此本发明不需要线偏振光进行激发，成本较低。2、本发明的激发光光源单元可以包括一个以上的激发光光源，因此通过宽场成像可以同时得到观察区域众多荧光探针的信号。3、本发明通过高精度机械拉伸单元对待测样品进行拉伸测试，获得待测样品应力应变数据，同时采用单分子荧光成像单元在待测样品形变过程中进行单分子显微成像，通过外部计算机将高精度机械拉伸单元获得待测样品应力应变数据与单分子荧光成像结果进行关联分析后得到不同样品形变状态下荧光探针周围分子链的运动和空间取向信息从而得到玻璃态聚合物在局部和观察区域整体的链响应信息。综上，本发明能够以单分子级别的实验测试手段更精细地研究玻璃态聚合物在形变过程中的链响应行为。

附图说明

图1是本发明测量系统的原理示意图；

图2是本发明的高精度机械拉伸单元的结构示意图；

图3是本发明的高精度机械拉伸单元的侧视示意图。

具体实施方式

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”等仅仅是用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

本发明的基于单分子荧光显微成像获取聚合物形变时的测量系统，包括激发光光源单元、光学显微单元、高精度机械拉伸单元以及单分子荧光成像单元。

如图1所示，激发光光源单元包括一个以上的激发光光源1(本发明实施例中采用波长为473nm和波长为532nm的两个激发光光源，以此为例，不限于此，可以根据需要进行设置)、若干反射镜2、一格兰泰勒棱镜3、两光阑、一1/4波片5、五光学透镜、一快门7、一斩波器8和一中性密度滤波片9。

两个激发光光源1发出不同波长的激发光分别经若干反射镜2反射后依次进入格兰泰勒棱镜3起偏成为线偏振光，经格兰泰勒棱镜3出射的线偏振光经第一光阑41发射到1/4波片5形成圆偏振光以激发各个方向取向的荧光探针，经1/4波片5出射的圆偏振光经反射镜2反射，并依次发射到第一光学透镜61、快门7和第二光学透镜62，第一光学透镜61和第二光学透镜62组成4f系统消除光路快门7孔径与光束束径不匹配带来的影响，经第二光学透镜62出射的激发光经反射镜2反射到斩波器8，斩波器8对激发光的频率进行调制后通过第二光阑42发射到中性密度滤波片9进行滤波处理，经中性密度滤波片9出射的激发光经反射镜2反射并依次进入第三光学透镜63和第四光学透镜64，第三光学透镜63和第四光学透镜64之间的间距可根据实际进行调节，通过调节第三光学透镜63和第四光学透镜64实现激发光于光学显微单元的高数值孔径物镜10负焦平面处聚焦从而出射为平行扩束的圆偏振光。

经第四光学透镜64出射的圆偏振光经反射镜2反射进入光学显微单元，光学显微单元采用倒置显微镜，激发光经高数值孔径物镜10聚焦待测样品，待测样品固定设置在高精度机械拉伸单元11上，高精度机械拉伸单元11用于对待测样品进行拉伸测试，获得待测样品应力应变数据，激发光激发待测样品的荧光探针产生荧光，荧光信号经高数值孔径物镜10收集并经反射镜2透射，经反射镜2透射的荧光经第五光学透镜65和反射镜2发射到单分子荧光成像单元12，单分子荧光成像单元12用于在待测样品形变过程中进行单分子显微成像，即对扩散慢体系(凝胶、高分子固体薄膜等)内的荧光探针进行实时追踪成像，本发明可以通过外部计算机将高精度机械拉伸单元11获得待测样品应力应变数据与单分子荧光成像结果进行关联分析后得到不同样品形变状态下荧光探针周围分子链的运动和空间取向信息从而得到玻璃态聚合物在局部和观察区域整体的链响应信息。

在一个优选的实施例中，单分子荧光成像单元12可以采用高灵敏度EMCCD相机。

在一个优选的实施例中，高精度机械拉伸单元11为原位单轴双向机械拉伸装置，如图2～3所示，高精度机械拉伸单元包括基板11-1、高性能伺服电机(图中未示出)、具有双向螺纹的传动轴(可以为双向丝杠)11-2和样品固定/拉伸组件11-3。基板11-1包括下层基板11-11、中层基板11-12和上层基板11-13，相邻层间基板之间不直接接触而通过导轨11-4间接固定，例如下层基板11-11与中层基板11-12之间设置X方向导轨，中层基板11-12与上层基板11-13之间设置Y方向导轨，层间导轨用于X-Y面的调节从而实现在拉伸方向及垂直于拉伸方向上的位置调节，下层基板11-11用于与倒置显微镜进行固定，高性能伺服电机固定连接双向螺纹的传动轴11-2，双向螺纹的传动轴11-2分别固定连接样品固定/拉伸组件11-3，外部的计算机通过控制高性能伺服电机运动实现对待测样品形变的精确控制。为了平衡受力，样品固定/拉伸组件11-3通过固定设置在上层基板11-13的并行双导轨11-5实现滑动，保证了形变测试的稳定性，样品固定/拉伸组件11-3的具体结构不做限制，只要能够实现对待测样品的固定/拉伸即可，例如夹子等。

下面详细说明本发明的基于单分子荧光显微成像获取聚合物形变时的测量系统的具体使用过程为：

1、打开激发光光源1并将扩束后的激发光束调节准直使之成为平行的圆偏振光；

2、调节光学显微单元，根据实验需要将成像模式设置为全内反射或透射；

3、将高精度机械拉伸单元11的基板11-1及样品固定/拉伸组件11-3位置归零；

4、取待测样品使其固定于样品固定/拉伸组件11-3上，在拉伸方向及垂直于拉伸方向上微调使观察目标位置处于高数值孔径物镜10正上方；

5、切换到所需放大倍数物镜，调节高数值孔径物镜10高度使之达到合适的聚焦位置；

6、打开高精度机械拉伸单元11，并进行拉伸方案设置；

7、调节光学显微单元和单分子荧光成像单元12，以达到最佳成像效果；

8、单分子荧光成像单元12进行成像录制，并启动高精度机械拉伸单元11执行所设定的拉伸方案；

9、通过高精度机械拉伸单元11获得待测样品应力应变数据，与单分子荧光成像结果进行关联分析后得到不同样品形变状态下玻璃态聚合物在局部和观察区域整体的链响应信息；

10、按需切换不同放大倍数物镜，参照上述步骤以进行不同尺度观察与分析。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。