一种用于检测双酚A的适配体传感器及其制备方法与流程

本发明属于电化学生物传感器的技术领域，涉及一种导电金刚石膜、金纳米颗粒、适配体和巯基己醇的复合材料传感器及其制备方法。

背景技术：

农药、医药等有机污染物的存在严重影响着水生态系统和人类健康。过去几十年，双酚A等内分泌干扰物引起了全世界的广泛关注。双酚A广泛应用到化工领域，主要用于塑料的制造，如食品包装、饮料瓶、储存设备、餐具、奶瓶、医疗器械等。然而，双酚A的毒性会导致人类发育障碍、流产、冠心病和乳腺癌等等。因此许多国家已经禁止奶瓶以及其他包装中含有双酚A。欧洲食品安全局公布的目前每日摄取量不高于4μg/kg。即使在非常低的浓度(甚至低于4.4×10^–12mol/L)都可以引起异常的生理变化。双酚A具有积累作用，在极低痕量的情况下，检测和发现双酚A，可以避免长期积累引起环境和人体危害。目前常见的双酚A检测手段包括液相色谱法、液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用、酶联免疫吸附法、毛细管电泳法、固相萃取法等。这些方法在检测过程中会产生大量有害的有机溶剂，需要复杂的预处理过程，仪器设备昂贵，而且大部分的检测水平都集中在10^–9～10^–12mol/L。因此设计和制作一种更灵敏的双酚A检测方法和传感器很有必要。

近几年来，电化学方法由于其简单、灵敏度高、试剂量小、动态范围宽、检测限低、仪器成本低等优势，是电化学检测的重要方法。合适的传感器材料和结构的选择非常重要。通常使用玻碳、金或石墨等材料并表面加以修饰制作传感器。但双酚A的电化学活性相对较弱，其氧化产物易于附着到这些传感器表面，降低了传感器的效率和重复性。因此为了进一步减少双酚A的检测限，合适的传感器材料和结构是关键。硼掺杂金刚石具有独特的化学惰性、宽电位窗口、极低的背景电流、高电流密度、极好的电化学稳定性、高抗垢能力等优点。利用硼掺杂金刚石表面终端改性可取得2.1×10^–7mol/L的双酚A检测水平，利用络氨酸酶修饰可降低至1×10^–11mol/L浓度。但尚没有达到低于10^-12mol/L的相关方法和报道。

和本发明接近的现有技术是公开号为CN 104267084A，名称为“检测双酚的电化学传感器及其制备方法和应用”的专利申请，制备方法是称取石墨烯8～15mg,量取0.1～0.3ml 1-丁基-3-甲基咪哩六氟磷酸盐分散于1～5ml的二甲基甲酞胺中超声70～120min,取5～12ul悬浊液滴涂在玻碳电极表面,红外灯烤15～25min,与电化学工作站连接。检测线性范围在2×10^-8～2×10^-6mol/L，检测限8×10^-9mol/L，高于本申请发明中的检测限(5～7×10^-15mol/L)。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，通过功能材料的选择和特殊结构的设计，将金纳米颗粒、适配体、巯基己醇和导电金刚石膜相结合，获得一种检测限低、重复性好、灵敏度高、特异性强、成本低的一种新的双酚A适配体传感器。

本发明在硼掺杂金刚石膜上通过离子溅射沉积金膜，并在管式炉中退火得到金纳米颗粒，以增加电极的电子传输能力。最后利用适配体和巯基己醇自组装，以提高传感器的特异性识别能力和检测水平。本发明双酚A适配体传感器的具体技术方案如下。

一种用于检测双酚A的适配体传感器，以掺硼金刚石膜为基底，掺硼金刚石膜1上沉积有金纳米颗粒2，在金纳米颗粒2上自组装适配体3，并有巯基己醇4占据金纳米颗粒上的适配体遗留的空白位点；所述的适配体3，结构为

5'-SH-(CH2)6-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3'。

巯基己醇具体的是6-巯基己-1-醇。

所述的金纳米颗粒，平均尺寸5～10nm，金纳米颗粒密度10¹¹～10¹²/cm²。

本发明的用于检测双酚A的适配体传感器具有检测限低、重复性好、灵敏度高、特异性强、成本低的特点。

本发明的用于检测双酚A的适配体传感器制备方法的具体技术方案如下。

一种用于检测双酚A的适配体传感器的制备方法，通过微波等离子体化学气相沉积或/和热丝化学气相沉积法在硅衬底上生长掺硼金刚石膜；然后在掺硼金刚石膜表面利用电子溅射或磁控溅射方法溅射金膜；将所得的金膜/掺硼金刚石膜在高温管式炉中，800～850℃退火0.5～2分钟，去离子水清洗，得到金纳米颗粒/掺硼金刚石膜结构；将2～2.5μmol/L的适配体置于干燥的金纳米颗粒/掺硼金刚石膜表面，于37～39℃下密闭8～16小时；在去离子水浸泡清洗2～3小时，再浸入1mmol/L的巯基己醇溶液中修饰1～3小时，得到用于检测双酚A的适配体传感器。

可以直接使用巯基修饰适配体制得用于检测双酚A的适配体传感器。具体的技术方案如下。

一种用于检测双酚A的适配体传感器的制备方法，通过微波等离子体化学气相沉积或/和热丝化学气相沉积法在硅衬底上生长掺硼金刚石膜；然后在掺硼金刚石膜表面利用电子溅射或磁控溅射方法溅射金膜；将所得的金膜/掺硼金刚石膜在高温管式炉中，800～850℃退火0.5～2分钟，去离子水清洗，得到金纳米颗粒/掺硼金刚石膜结构；将2～2.5μmol/L的巯基修饰适配体置于干燥的金纳米颗粒/掺硼金刚石膜表面，于37～39℃下密闭8～16小时，用去离子水冲洗干净，得到用于检测双酚A的适配体传感器。

在上述的两种制备过程中，所述的溅射金膜，厚度最好是10～30nm，溅射时间可以是5～8秒。所述的金纳米颗粒，平均尺寸5～10nm，金纳米颗粒密度10¹¹～10¹²/cm²。

在上述的两种制备过程中，所述的置于，可以是滴加，也可以是浸泡。

本申请制备的双酚A适配体传感器灵敏度高，特异性好。实验测量结果表明，所得传感器在1.0×10^-14～1.0×10^-9mol/L浓度范围具有良好的线性关系，检测限达到5～7×10^-15mol/L飞摩水平。现有的传统检测方法检测最低极限在10^-12mol/L，检测过程中会产生大量有机溶液，预处理复杂、价格昂贵。本发明可以得到10^-15mol/L检测限，检测能力远高于目前报道双酚A传感器，在应用于牛奶实际样品中获得良好的回收率。

本发明中设计的金刚石与适配体结合的结构，用于双酚A的检测尚属首次，掺硼金刚石的选择以及合理的结构设计有利于提高双酚A检测能力。这种新型双酚A适配体传感器(巯基己醇/适配体/金纳米/金刚石复合材料)作为双酚A检测材料，灵敏度高、特异性强、重复性好，检测限低，是本发明专利所涉及的主要内容和重要创新点。并且制备方法工艺简单，成本低廉。随着对检测便捷需求的日益增加，检测快速，效率高，稳定性强的新一代双酚A传感器变得意义重大。

附图说明

图1为本发明用于检测双酚A的适配体传感器的结构示意图。图中，1为掺硼金刚石膜，2为金纳米颗粒，3为适配体，4为巯基己醇。

图2为实施例1制得的金膜/掺硼金刚石膜扫描电子显微镜形貌图。

图3为金纳米颗粒/掺硼金刚石膜高倍数形貌图。

图4为实施例1的适配体传感器的制备过程及检测原理示意图。

图5为本发明的适配体传感器的阻抗与双酚A的浓度对应关系的测试图。

图6为本发明的适配体传感器的相对阻抗变化与双酚A的浓度对应关系的曲线图。

图7为本发明的适配体传感器与不同干扰物作用后的相对阻抗响应柱状图。

具体实施方式

以下结合附图与实施例对本申请作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本申请的理解，而对其不起任何限定作用。

实施例1：用于检测双酚A的适配体传感器的制备(1)

导电金刚石膜(硼掺杂)通过微波等离子体化学气相沉积设备沉积到硅衬底上。然后在金刚石表面离子溅射金靶6秒，得到金膜/掺硼金刚石膜结构(见图2)，样品转移至高温管式炉中，高温退火1分钟，并去离子水清洗，获得金纳米颗粒/金刚石膜结构(见图3)。将2μmol/L的适配体滴加到金纳米颗粒/掺硼金刚石膜表面，于37～39℃下密闭过夜，用缓冲液冲洗干净；随后将所得电极浸入1mmol/L的巯基己醇(6-巯基己-1-醇(MCH))溶液中修饰2小时，得到用于检测双酚A的适配体传感器。

所述的适配体，是从随机单链寡聚核苷酸文库中筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能特异性结合蛋白，长度一般为25～60个核苷酸，可以是DNA或者是RNA。本实施例选择的双酚A适配体具体结构是5'-SH-(CH2)6-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3'。

该适配体传感器的检测线可以达到5～7×10^-15mol/L。

实施例2：用于检测双酚A的适配体传感器的制备(2)

硼掺杂导电金刚石膜通过微波等离子体化学气相沉积或/和热丝化学气相沉积法沉积到硅衬底上。然后在导电金刚石表面利用电子溅射或磁控溅射方法溅射一层金膜，时间5～8秒，厚度10～30nm。将所得金膜/金刚石膜在高温管式炉中，800～850℃退火1～2分钟，并去离子水清洗，获得金纳米颗粒/金刚石膜结构(参见图3)。在密闭容器中，将2～2.5μmol/L的巯基修饰适配体分散到干燥的金纳米颗粒/金刚石表面，于37～39℃下过夜组装，在去离子水浸泡清洗2～3小时，得到双酚A适配体传感器。

本实施例的巯基修饰适配体可选择上海生物工程股份有限公司合成的产品。本实施例与实施例1制得的双酚A适配体传感器性能基本相同，该适配体传感器的检测线可以达到10^-13mol/L。

实施例3：用于检测双酚A的适配体传感器的制备(3)

在实施例1的基础上，管式炉烧结也高温退火可以是10～30秒；6-巯基己-1-醇(MCH)溶液中修饰也可以是浸泡0.5～1小时时间。

实施例4：用于检测双酚A的适配体传感器的性能测试

从图2的扫描电子显微镜图像中可以看到，制备的导电多晶金刚石膜平均尺寸在10μm，金纳米颗粒均匀的沉积在其表面，密度约4×10¹¹/cm²(参见图3)，为适配体提供丰富的活性结合位点。

双酚A适配体传感器的制备过程和检测原理如图4所示。通过等离子溅射方法在硼掺杂金刚石电极表面溅射一层金膜(图4中a-b)；后在管式炉中进行热处理，形成金纳米颗粒(图4中c)；将上述电极浸泡在适配体溶液中，适配体会在Au-S共价键的作用下，嫁接到金纳米颗粒上(图4中d)；随后用巯基己醇封闭占据空白位点，以减小非特异性吸附(图4中e)，至此用于检测双酚A的适配体传感器制备完成。当不同浓度双酚A接触检测双酚A的适配体传感器时，电极上的适配体会与其特异性结合，产生不同的阻抗变化(图4中f)。

利用制备的用于检测双酚A的适配体传感器对一系列浓度的双酚A进行了阻抗测试，如图5所示。传感器的阻抗随着双酚A浓度的增加而增加，直到达到最大值。定义(R_ct-R_ct0)除以R_ct0作为相对阻抗(即(R_ct-R_ct0)/R_ct0，R_ct代表双酚A适配体传感器与一定浓度双酚A结合后的阻抗值，R_ct0代表双酚A适配体传感器的初始阻抗)。由此可以得到相对阻抗(％)与双酚A浓度的对数线性关系，如图6所示。线性方程为相对阻抗(％)＝301.3+17.7logC,R²＝0.995，C为双酚A的浓度，R为相关系数。通过三倍信噪比进行计算出传感器的检测限为7.2×10^-15M。相对阻抗变化率与双酚A浓度的对数呈线性关系，范围为1.0×10^-14～1.0×10^-9mol/L。

实施例5：用于检测双酚A的适配体传感器的特异性测试

为了研究传感器的特异性，选取了5种和双酚A结构类似的干扰物(雌二醇、雌三醇、邻苯二甲酸二乙酯、间苯二酚和壬基酚)，进行干扰性实验。在0.5×10^-12mol/L双酚A体系中，分别加入100倍于双酚A浓度的干扰物，进行阻抗测试。定义双酚A阻抗值为100％，其余干扰物阻抗相较于双酚A阻抗折算为对应百分比，图7中可以看到，5种干扰物相对相应变化在-2％～4.5％之间，表明干扰物对传感器检测的影响很小，即使5种干扰物全部混合在体系中，相应变化依然小于13％，证明了传感器在复杂环境下的应用前景。