一种利用电声脉冲法测量细胞悬液电特性的方法与流程
本发明涉及一种测量细胞悬液电特性的方法，具体涉及一种利用电声脉冲法测量细胞悬液电特性的方法。
背景技术：
细胞膜是与环境进行物质、能量和信息交换的通路，是细胞最重要的细胞器。细胞膜电特性主要与细胞膜内、外离子浓度差有关，研究和了解细胞膜电特性具有重要意义，其关系到生命的生存与否，可以揭示生命的奥秘，促进生命科学、临床医学、农业、畜牧业等学科的发展。
目前，针对细胞膜电特性的研究主要有细胞电泳法、电化学阻抗法、膜片钳技术等方法。细胞电泳法是在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生涌动，根据细胞的电泳淌度来检测细胞膜电特性，它主要存在操作较繁琐、所需时间较长、重复性和灵敏度较差等缺点。荧光显微镜法是一种利用荧光染料在特定波长的激发下荧光强度的变化来表征细胞膜电位的变化，此方法荧光染料对温度和光照要求苛刻、操作过程复杂、重复性和精度差等缺点。膜片钳技术是一种利用微玻璃管电极接触细胞膜(1-3个离子通道、几个平方微米)以记录通过细胞膜离子通道的离子电流来反映细胞膜单一或多个离子通道分子活动的技术。这种方法虽然精度很高，但是设备昂贵、耗时耗力、无法获取细胞集群整体的电活动状态。
本发明提出的电声脉冲法是将细胞悬液置于脉冲电场电磁环境中，检测的声信号不会受到电磁场的干扰，经压电传感器转换后得到电信号，因此可以实时动态地监测细胞悬液的电特性。电声脉冲法(PulsedElectro-Acoustic Method，PEA)是一种目前在国际上应用较多的介质材料中空间电荷测量技术。PEA测量原理如图3所示，假定在厚度为d的平板试样中存在空间电荷ρ，如果在电极1与电极2之间施加一个脉宽为△T的电脉冲U，电脉冲作用在位于x处的空间电荷ρ(x)的小薄片△x上，产生的力为△f3(t)。这个力作用于电荷ρ(x)使其轻微移动，这种运动会产生一个声脉冲△P3(x，t)，沿电场方向传播通过试样与电极2到达压电传感器。通过压电传感器将声波P(t)转换为电信号V(t)。假定作用在样品内所有电荷上的力与周围介质和电极紧密耦合在一起，并且电脉冲是理想的陡脉冲，压电传感器和前置放大器也是理想的，则前置放大器的输出电压Vs(t)与空间电荷的分布ρ(t)呈线性关系。那么通过PEA方法测量得到Vs(t)就可以得到空间电荷分布。
到目前为止，PEA方法主要用于固体薄膜材料和电缆绝缘层中空间电荷分布的测量与研究。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用电声脉冲法测量细胞悬液电特性的方法，该方法提出了“三层复合介质模型”，将细胞悬液置于两层厚度为150-180μm的低密度聚乙烯(LDPE)固体薄膜之间，通过电极1和电极2给试样施加千伏级的偏置电压和纳秒级脉冲电信号，偏置电压要确保细胞膜不被击穿(细胞膜的击穿场强为103kV)。在电极2处通过聚四氟乙烯(PVDF)压电传感器将检测到的声波信号转换成电信号，最后通过分析计算得到细胞膜电特性，该方法的基本原理是电介质材料中存在的空间电荷在外加脉冲电场的作用下会受力产生位移，形成机械波，通过压电传感器将含有空间电荷信息的声信号转化为电信号，即可以研究电介质材料中的空间电荷分布情况。而细胞与外界发生物质、能量和信息交换的过程均与细胞膜电特性有着密切关系。该方法不但实现设备简单、操作容易，而且对细胞没有任何损伤。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种利用电声脉冲法测量细胞悬液电特性的方法，包括以下方法：
1)建立三层复合介质模型，由两层低密度聚乙烯(LDPE)薄膜外设置电极组成，在两层低密度聚乙烯(LDPE)薄膜中间放置待测细胞悬液；
2)为了简化计算需做如下假设：
a)认为低密度聚乙烯(LDPE)薄膜是完全均匀的；
b)在三层介质模型中，由于细胞层很薄，而且测量时夹于电极之间，认为细胞层呈单层排列，是一层由细胞和盐溶液均匀分布的混合电介质；
c)所需细胞悬液是经大鼠尾部采集的新鲜血液经过离心处理后，将红细胞与生理盐水配制成需要浓度；
3)确保测量模型的准确性；
假设，当施加的偏置电压U＝0时，低密度聚乙烯中不会产生空间电荷，电极也没有给细胞悬液试样注入电荷，由于聚乙烯和理想单细胞层的介电常数不一样，由于界面效应在分界面上会产生界面自由电荷，其电荷面密度由式(1)表示为：
式中，d1＝180μm，d2≈10μm，εr1≈2.2，εr2≈75，ε0＝8.85×10-12F/mγ1＝10-14S/m，γ2＝10-10S/m，
则从低密度聚乙烯到细胞层的界面上的界面电荷由式(2)表示为：
而从细胞层到低密度聚乙烯的界面上的界面电荷由式(3)表示为：
由此可知，在细胞与聚乙烯的两个分界面上都会产生界面电荷，但它们大小相等，极性相反，此外，当电荷密度很小，在不施加偏置电压时对于这些界面电荷的影响可以忽略；
两个分界面上的界面电荷在低密度聚乙烯中产生的电场强度由式(4)、式(5)分别进行计算：
而由理想单细胞层细胞膜上的电荷在低密度聚乙烯中产生的电场强度由式(6)、式(7)表示为：
其中细胞膜电荷一般为σCell＝0.533×10-10C/m2，为细胞单层排列时的面密度。
由电场的叠加原理可得：
EPE＝E1+E2+EC (7)
可得低密度聚乙烯中的电场强度由式(8)表示为：
由此可见，理想单细胞层的引入产生的界面效应对测量波形没有影响，反映在波形变化上就只有理想细胞层带电产生。
进一步，三层复合介质模型当施加了偏置电压后，达压电传感器处声波信号的检测，用声压表示，声波在三层复合介质中的传播，压电传感器检测到的声强由为式(9)表示为：
式中，K为界面反射系数，T为透射系数，α1：声波在细胞悬液中的衰减系数；α为声波在聚乙烯中的衰减因子；Z：波阻抗，Z＝ρc，ρ为介质密度/kg·m-3，c为声波在介质中传播速度/m·s-1；x：声波产生点到电极2的距离/μm；
声波信号经反射、透射经压电传感器检测并转换、放大后成电压信号，两者之间具有线性关系比例系数为k，检测的电压信号可以按式(10)计算：
U＝k·P (10)。
本发明的有益效果是：
本发明提出了“三层复合介质模型”，将细胞悬液置于两层厚度为150-180μm的低密度聚乙烯(LDPE)固体薄膜之间，通过电极给试样施加千伏级的偏置电压和纳秒级脉冲电信号，偏置电压要确保细胞膜不被击穿(细胞膜的击穿场强为103kV)，在电极处通过聚四氟乙烯(PVDF)压电传感器将检测到的声波信号转换成电信号，最后通过分析计算得到细胞膜电特性。该方法不但实现设备简单、操作容易，而且对细胞没有任何损伤。将传统电声脉冲法应用于研究细胞悬液电特性的研究，可以无损监测细胞膜电特性的动态变化情况，为电生理学研究提供一种全新的测量方法。为电生理学的研究提供一种全新的测量手段，有助于揭示细胞与外电场交互过程的物理本质提供依据。
附图说明
图1为三层复合介质模型示意图。
图2为声波在三层复合介质中传播模型示意图，其中Pe2-PE:电极2/聚乙烯A分界面处的声压；PρA:空间电荷ρA处的声压；PA-B:电介质A/电介质B分界面处的声压；PKA-B:表面电荷KA-B处的声压；PρB:空间电荷ρB处的声压；Pe1-PE:电极1/聚乙烯B分界面处的声压；ε：介质的介电常数。
图3为PEA测量原理示意图。
图4为SD大鼠红细胞显微图片
图5为不同体积细胞悬液试样在10kV/mm电场下测量曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步叙述。
一种利用电声脉冲法测量细胞悬液电特性的方法，包括以下方法：
1)建立三层复合介质模型，由两层低密度聚乙烯(LDPE)薄膜外设置电极组成，在两层低密度聚乙烯(LDPE)薄膜中间放置待测细胞悬液；
2)为了简化计算需做如下假设：
a)认为低密度聚乙烯(LDPE)薄膜是完全均匀的；
b)在三层介质模型中，由于细胞层很薄，而且测量时夹于电极之间，认为细胞层呈单层排列，是一层由细胞和盐溶液均匀分布的混合电介质；
c)所需细胞悬液是经大鼠尾部采集的新鲜血液经过离心处理后，将红细胞与生理盐水配制成需要浓度；
3)确保测量模型的准确性；
假设，当施加的偏置电压U＝0时，低密度聚乙烯中不会产生空间电荷，电极也没有给细胞悬液试样注入电荷，由于聚乙烯和理想单细胞层的介电常数不一样，由于界面效应在分界面上会产生界面自由电荷，其电荷面密度由式(1)表示为：
式中，d1＝180μm，d2≈10μm，εr1≈2.2，εr2≈75，ε0＝8.85×10-12F/mγ1＝10-14S/m，γ2＝10-10S/m，
则从低密度聚乙烯到细胞层的界面上的界面电荷由式(2)表示为：
而从细胞层到低密度聚乙烯的界面上的界面电荷由式(3)表示为：
由此可知，在细胞与聚乙烯的两个分界面上都会产生界面电荷，但它们大小相等，极性相反，此外，当电荷密度很小，在不施加偏置电压时对于这些界面电荷的影响可以忽略；
两个分界面上的界面电荷在低密度聚乙烯中产生的电场强度由式(4)、式(5)分别进行计算：
而由理想单细胞层细胞膜上的电荷在低密度聚乙烯中产生的电场强度由式(6)、式(7)表示为：
其中细胞膜电荷一般为σCell＝0.533×10-10C/m2，为细胞单层排列时的面密度。
由电场的叠加原理可得：
EPE＝E1+E2+EC (7)
可得低密度聚乙烯中的电场强度由式(8)表示为：
由此可见，理想单细胞层的引入产生的界面效应对测量波形没有影响，反映在波形变化上就只有理想细胞层带电产生。
进一步，三层复合介质模型当施加了偏置电压后，达压电传感器处声波信号的检测，用声压表示，声波在三层复合介质中的传播，压电传感器检测到的声强由为式(9)表示为：
式中，K为界面反射系数，T为透射系数，α1：声波在细胞悬液中的衰减系数；α为声波在聚乙烯中的衰减因子；Z：波阻抗，Z＝ρc，ρ为介质密度/kg·m-3，c为声波在介质中传播速度/m·s-1；x：声波产生点到电极2的距离/μm；
声波信号经反射、透射经压电传感器检测并转换、放大后成电压信号，两者之间具有线性关系比例系数为k，检测的电压信号可以按式(10)计算：
U＝k·P (10)。
(1)实施例1
SD大鼠红细胞悬液电特性检测
实验材料：从SD大鼠尾部取出一定量(50μL)的新鲜血液，家肝素钠，离心机离心处理10min，3000r/min，弃上层血清。将红细胞用0.9％生理盐水稀释后，二次放入离心机离心处理15min，3000r/min，弃上层清液。随后将红细胞进行稀释后配制成一定浓度的红细胞悬液待用。
图4为SD大鼠红细胞显微图片，放大倍数为1000。细胞浓度为6.4×105个/L，基本呈现出单细胞层排列状态。
图5为不同体积细胞悬液试样在10kV/mm电场下测量曲线。从图5可以看出在固定的直流偏压和脉冲电场作用下，可以定量检测出SD大鼠血红细胞的带电量，且红细胞带电量与其体积成正比。
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