基于聚腺嘌呤‑亚甲基蓝电化学传感器检测铜离子的方法与流程

本发明涉及一种基于聚腺嘌呤-亚甲基蓝的电化学传感器检测铜离子的方法，属于分析化学领域。

背景技术：

Cu（Ⅱ）是人体生命健康所必需的过渡元素，与某些蛋白质在一起，可产生大量对生命至关重要的酶。铜离子也是所有已知的生命形式的微量营养元素，它具有多种功能（Viguier， R. F. H.； Hulme，A. N. ，A sensitized europium complex generated by micromolar concentrations of copper(I): Toward the detection of copper(I) in biology. J. Am. Chem. Soc. 2006，128，11370–11371.），参与骨的形成、细胞呼吸和结缔组织发展等。然而，过量的铜离子会对人体的肝脏和神经系统造成伤害，使细胞的自动调节功能受到损伤，造成严重的神经变性疾病，如门克斯病，威尔逊病和阿尔茨海默氏病等（Bush，A. I.Metals and neuroscience. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000，4，184–191； Kaler，S. G.；Holmes，C. S.；Goldstein，Neonatal diagnosis and treatment of Menkes Disease.N. Engl. J. Med. 2008，358，605–614； Ala，A.；Walker， A. P.； Ashkan， K.，Wilson's disease. M. L. Lancet 2007，369，397–408）。美国环境保护署（EPA） 规定了在饮用水中铜的最大允许浓度为1.3 ppm（约20 μM）(Liu，J. W.；Lu，Y. J.， A DNAzyme catalytic beacon sensor for paramagnetic Cu²⁺ ions in aqueous solution with high sensitivity and selectivity. Am. Chem. Soc. 2007，129，9838–9839.）。尽管如此，由于农业和工业的广泛使用，铜污染及其对人类潜在的毒性作用依然是一个挑战。

目前，Yao Wu 等（Yao Wu；Rebecca Y. Lai，Electrochemical gold(III) sensor with high sensitivity and tunable dynamic range. Analytical Chemistry. 2016，40（8），2227-2233）证明了Au（Ⅲ）能与腺嘌呤A形成A- Au（Ⅲ）-A结构，首次制备了利用DNA进行识别检测Au（Ⅲ）的简便快速的电化学传感器，同时指出腺嘌呤A还可与Cu（Ⅱ）等过渡金属通过氮原子结合在一起。

当前检测铜离子的常规技术一般都是基于电感耦合等离子体（ICP）的方法，包括质谱（MS）（Pavla Jungova，Jarmila Navratilova，Substrate-assisted laser desorption inductively-coupled plasma mass spectrometry for determination of copper in myeloid leukemia cells. J. Anal. At. Spectrom. 2010，25，662–668.；S. D. Richardson，Mass spectrometry in environmental sciences. Chem. Rev. 2001，101–211.），原子吸收光谱（Chan， M. S.；Huang，S. D.，Direct determination of cadmium and copper in seawater using a transversely heated graphite furnace atomic absorption spectrometer with Zeeman-effect background corrector. Talanta 2000，51，373–380. ； Lin，T. W.；Huang，S. D.，Direct and simultaneous determination of copper，chromium，aluminum，and manganese in urine with a multielement graphite furnace atomic absorptionspectrometer. Anal. Chem. 2001，73，4319–4325. ；Pourreza，N.；Hoveizavi.，R.，Simultaneous preconcentration of Cu，Fe and Pb as methylthymol blue complexes on naphthalene adsorbent and flame atomic absorption determination. Anal. Chim. Acta 2005，549，124–128. ）和原子发射光谱法等(Becker， J. S.；Matusch，A.； Liu，Y.；Liang，P.；Guo，L.，Nanometer titanium dioxide immobilized on silica gel as sorbent for preconcentration of metal ions prior to their determination by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. Talanta 2005，68，25–30.）。此外，也可采用荧光技术检测铜离子（Nakorn Niamnont；Nattaporn Kimpitak；Gamolwan Tumcharern；Paitoon Rashatasakhon，Highly sensitive salicylic fluorophore for visual detection of picomole amounts of Cu²⁺.RSC Adv.2013，3 (3)，25215-25220.；Balamurugan Rathinam；Chih-Chieh Chien；Bo-Cheng Chen； Jui-Hsiang Liu，Fluorogenic and chromogenic detection of Cu²⁺ and Fe³⁺ species in aqueous media by rhodamine–triazole conjugate. Tetrahedron.2013，69 (1)，235-241.）。这些技术通常需要繁琐的过程，使得难以快速检测铜离子。因此，利用可靠的技术来对铜离子进行快速检测是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明在于提供一种基于聚腺嘌呤-亚甲基蓝的电化学传感器检测铜离子的方法，该方法以电化学工作站为平台，能够简便、快速地检测铜离子浓度。

本发明采取的技术方案如下：

一种基于聚腺嘌呤-亚甲基蓝的电化学传感器检测铜离子的方法，按照以下步骤进行：

（1）金电极（GE, d=2 mm）处理：依次用0.3 μm和0.05 μm的Al₂O₃抛光粉打磨金电极，用MilliQ纯水、无水乙醇和MilliQ纯水依次超声清洗2 min后，在0.5 M H₂SO₄溶液中用循环伏安法，扫描范围为0.2 - 1.6 V，以扫速0.1 V /s、0.5 V /s分别扫描20圈，直至得到稳定的循环伏安曲线；

（2）根据文献Yao Wu；Rebecca Y. Lai；Electrochemical gold(III) sensor with high sensitivity and tunable dynamic range. Analytical Chemistry. 2016，40（8），2227-2233. 中的方法用缓冲液配制1.2 μM的DNA（A₁₂）溶液；缓冲液含5 mM PBS、0.05 M NaCl，pH 7.4；

（3）将5.0 μL步骤（2）中的DNA（A₁₂）滴加在步骤（1）处理好的金电极表面，在4℃反应2 h；

（4）用超纯水冲洗步骤（3）中的电极表面，N₂吹干，立即浸没在100.0 μL的2.0 mM巯基己醇（MCH）溶液中于4℃下封闭电极表面2 h；

（5）将上述步骤（4）制备的MCH/A₁₂/GE电极用二次蒸馏水浸泡4 min，N₂吹干后倒置，用于下一步检测；

（6）取20.0 μL MilliQ纯水（空白）或20.0 μL Cu²⁺ 溶液（不同浓度）于电化学检测缓冲液中，总体积为2.0 mL，将步骤（5）中的电极浸没于其中20 min；缓冲液含10 mM PBS、2M NaClO₄，pH 6.7；

（7）以铂丝为辅助电极，以银/氯化银为参比电极，（6）中的金电极为工作电极，采用交流伏安法进行检测，记录空白电流值I₀和不同浓度Cu²⁺溶液的电流值I₁；

（8）以已知铜离子浓度为横坐标，其对应的△I（△I = I₀- I₁）为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和△I的线性方程，然后根据待测样品的△I，计算对应的铜离子浓度。

所述铜离子浓度与△I的线性方程为△I/nA = 1.148+ 0.07358 C _Cu²⁺ / μM。

步骤（2）中所述的DNA（A₁₂）的序列为从左到右5’到3’： -HS-(CH ₂)₆-AAAAAAAAAAAA-(CH₂ )₆-MB-。

步骤（3）中的DNA（A₁₂）浓度为1.2 μM，加入量为5.0 μL。

上述方法可应用于环境水样中铜离子浓度的检测。

本发明具有操作简便，灵敏度高，选择性好，成本低等优点。在100 nM-25 μM的浓度范围内对铜离子的检测呈现良好的线性响应，检测限可达到13 nM。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明的一种DNA修饰在金电极表面的方法简便、快速、反应的时间和温度容易控制，得到的传感器较稳定，选择性较好。

（2）本发明的操作步骤简便、灵敏、便捷、成本低，而且无污染、无毒害，应用性强。

（3）本发明在识别铜离子的过程中，能快速读取电化学信号的数值，有利于铜离子快速检测。

附图说明

图1 为本发明对铜离子检测的响应曲线。（A）在不同铜离子浓度时所对应的信号I₁，从低到高分别为(a): 0 μM、 (b): 0.1 μM、 (c): 1.0 μM、(d): 2.0 μM、 (e): 5.0 μM、 (f): 10 μM、 (g): 25 μM；（B）为随着铜离子浓度的增加（100 nM-25 μM），其△I的变化。

图2 为本发明对铜离子检测的选择性。从左到右为在不同干扰物质中所示的△I信号，从左到右分别为Mn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺ 、 Pb²⁺、Cu²⁺和8种离子的混合溶液，铜离子的浓度为1.0 μM，所有干扰物质的浓度均为10 μM。

具体实施方式

实施例 1

1、DNA（A₁₂）的配制，具体步骤如下：

A、用缓冲溶液5 mM PBS、0.05 M NaCl (pH 7.4) 溶解DNA（A₁₂），浓度为10 μM。分为六管，将其置于冰箱中冷冻；

所述的DNA（A₁₂）的序列为从左到右5’到3’： -HS-(CH ₂)₆-AAAAAAAAAAAA-(CH₂ )₆-MB-；

B、取100 μL 10 μM的A₁₂，加入5.0 μL 10 mM的TCEP（磷酸（2-氯乙基）酯）溶液，于4℃下过夜备用；

C、在使用前用探针固定缓冲液（5 mM PBS、0.05 M NaCl，pH 7.4）稀释至所需的浓度（1.2 μM），取5.0 μL浓度为1.2 μM的DNA（A₁₂）进行金电极表面的自组装。

2、修饰有DNA的电化学传感器的制备与铜离子的检测，具体步骤如下：

（1）将电极浸泡在100 μL的2.0 mM巯基己醇（MCH）溶液中封闭电极表面2 h，以去除电极表面上的DNA非特异性吸附；

（2）将上述制备的MCH/A₁₂/GE电极用二次蒸馏水浸泡4 min，N₂吹干后倒置，用于下一步检测；

（3）取20.0 μL MilliQ纯水（空白）或Cu²⁺ 溶液（不同浓度）于电化学检测缓冲液（10 mM PBS、2M NaClO₄，pH 6.7 )中，总体积为2.0 mL，将电极浸没于其中20 min；

（4）采用交流伏安法(A.C.Voltammetry)进行检测，记录空白电流值I₀和不同浓度Cu²⁺溶液的电流值I₁。随着铜离子浓度的增加，对应的△I(△I= I₀- I₁)也增加，以已知铜离子浓度为横坐标，其对应的△I为纵坐标，绘制曲线，得到铜离子浓度和△I的线性方程，△I /nA = 1.148+ 0.07358 C _Cu²⁺/ μM。

实施例 2

湖水中铜离子的检测，具体步骤如下：

将湖水用0.22 μm的滤膜过滤，由于水样基质较复杂，通过标准加入法来测定湖水中Cu²⁺ 的浓度。在测定时， 取6份500 μL体积的样品，分别置于6个2 mL的离心管中，分别加入浓度为1.0 μM的Cu²⁺ 溶液0、100、200、300、400、500 μL，加水稀释至1.0 mL。将修饰有DNA （A₁₂）的金电极浸没于总体积为2.0 mL，分别含有 20.0 μL MilliQ纯水（空白）或上述配制水样的电化学检测缓冲液（10 mM PBS、2M NaClO_4，pH 6.7）中20 min，采用交流伏安法进行检测，检测电位为0到 -0.7 V记录数据。分别测定并计算空白与实验组的电流差值△I₁、△I₂、△I ₃、△I₄、△I₅、△I₆，作电化学信号变化△I对加入的Cu²⁺浓度曲线，得到回归方程为△I/μA= 1.0275 Ccu²⁺ / μM + 0.01543，当△I =0时，可计算出湖水中Cu²⁺浓度为0.03 μM。以同样的方法测得加标回收率为105%，相对标准偏差为3.7%，结果说明本发明所述方法可用于实际水样中铜离子的检测。

实施例 3

对铜离子的选择性考察，具体步骤如下：

将修饰有DNA （A₁₂）的金电极浸没于总体积为2.0 mL，分别含有 20.0 μL Mn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺ 溶液的电化学检测缓冲液（10 mM PBS、2M NaClO₄、pH 6.7）中20 min，铜离子浓度为1.0 μM，所有干扰离子的浓度均为10 μM，采用交流伏安法进行检测，检测电位为0到 - 0.7 V，记录数据。其结果如图2，说明本发明所述方法对铜离子的选择性良好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 基于聚腺嘌呤-亚甲基蓝电化学传感器检测铜离子的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列

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