一种肺癌监测试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种肺癌监测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：在世界范围内，无论男性还是女性，肺癌均已成为癌症死亡的主要原因。2005年估计中国肺癌的新发病例大约有500,000例（男性约330,000例，女性约170,000例），2007年美国肺癌的新发病例估计有213,380例，死亡160,390例在世界范围内。肺癌高死亡率的主要原因有二个：一是肺癌缺乏有效的早期诊断手段，70%以上的病人在确诊时已属晚期；二是晚期肺癌（尤其是非小细胞肺癌，nsclc）对化疗的敏感性差，现有的各种化疗方案对nsclc的总体有效率仅为30%左右。肺癌按解剖学部分分类可分为2类：中央型肺癌和周围型肺癌。中央型肺癌发生于肺段或肺段以上的支气管,主要为磷状上皮癌、小细胞癌、大细胞癌及类癌。周围型肺癌发生于肺段以下的支气管，见于各种组织学类型。其基本大体病理形态为肺内结节或肿块。肺癌组织病理学分类为两种基本类型，第一种是非小细胞型肺癌，另外一种是小细胞肺癌。肺癌的诊断目前主要通过以下几种方法，胸部影像学检查是诊断肿瘤最重要的方法之一，对早期诊断肺癌有重要意义。支气管镜除能直接观察病变形态特征及支气管狭窄情况外，还能通过经支气管镜肺活检、经纤支镜针吸细胞学检查（tbna）等直接选取组织进行病理检查，提高肺癌的诊断率，并对肺癌(尤其是nsclc)分期具有重要指导作用。支气管内超声检查（ebus）是在支气管镜引导下，通过超声探头对支气管腔内、气管及周围组织进行检查与治疗的方法。自动荧光支气管镜（afb）是利用细胞自发性荧光和电脑图像分析技术开发的新型纤维支气管镜，可明显提高气管镜对肺癌及癌前病变早期诊断的敏感性。电磁导航支气管镜（enb）结合传统支气管镜与螺旋ct仿真支气管镜的优点，可提高常规支气管镜对周围肺病灶的阳性检出率。光干涉断层扫描（oct）是将红外线分为两束光，一束直接照射，另一束经过反射再照射，两束光重叠产生光干涉现象，检测各层光反射的强弱和时间延迟，并经计算机处理，即得出与b型超声、ct类似的二次断层图像,其获得的反射图像高于以往任何方法的分辨率和敏感性。痰脱落细胞检查是诊断肺癌的重要手段，如痰标本收集方法得当，连续3次以上痰标本检查可提高中央型肺癌诊断率达80%，周围型肺癌诊断率达50%。肿瘤标志物检测方法简单、创伤小、可重复性好，是临床筛选及早期诊断肿瘤的首选方法，其在机体特定部位的表达对肿瘤的诊断相对特异。诊断肺癌常用的肿瘤标志物有癌胚抗原(cea)、神经元特异烯醇化酶(nse)、细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)、ca-125、肺癌相关抗原、血管内皮生长因子、增生细胞核抗原、表皮生长因子受体等。糖蛋白分子由多肽链和糖两部分组成。血清糖蛋白中任何变化可以反映人体的生理改变。近年来的糖组学研究也显示了寡糖链的改变与各种肿瘤的发生和发展有密切的相关性（参考文献：liu，x-e，desmyter，l，gao，c-f，laroy，w，dewaele，s，vanhooren，v，wang，l，zhuang，h，callewaert，n，libert，c，contreras，r，chen，c.n-glycomicchangesinhepatocellμlarcarcinomapatientswithlivercirrhosisinducedbyhepatitisbvirus.hepatology，46，1426-1435，2007.）。鉴于肺癌监测的不确定性，目前迫切需要一种能有效监测肺癌的试剂盒和监测评估方法。技术实现要素：解决的技术问题：本发明的目的是解决现有检测方法对肺癌监测的不确定，提供一种肺癌监测试剂盒及其使用方法，通过检测血液糖蛋白的n-糖苷键连接的碳水化合物（n-寡糖）含量的改变来评估肺癌的进展以及愈后肿瘤的复发。技术方案：一种肺癌监测试剂盒，由以下试剂组成：试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度5%的sds配制而成；试剂b：质量浓度浓度为不低于3.3%np40中加入不少于2.2单位/μl糖苷外切酶配制而成；试剂c：等体积20mmapts的1.2m柠檬酸和1m有机物还原剂的dmso的混合液；试剂d：不低于0.25μl浓度为100mm的nh4ac，不少于0.2μl的唾液酸酶，2.55μl双氧水。其中，所述有机物还原剂为nacnbh3。其中，试剂a的体积可以为2μl，试剂b的体积可以为4μl，试剂c的体积可以为2μl，试剂d的体积可以为2μl。上述肺癌监测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：步骤1，往稀释一倍的4μl血清加入2μl的试剂a，进行变性反应，加入4μl试剂b，37℃反应3小时后干燥，得到样品；步骤2，在所得样品中加入2μl试剂c，进行荧光标记，然后加入200μl水终止标记反应，得到荧光标记后的样品；步骤3，将2μl试剂d加至2μl荧光标记后的样品，进行去末端唾液酸反应，加入200μl的水终止标记反应，得到去末端唾液酸反应的样品；步骤4，取10μl去末端唾液酸反应的样品，用abi测序仪进行寡糖链片分离，得到图谱。进一步地，步骤1变性反应的条件为不低于95℃加热。进一步地，步骤2中荧光标记的条件为60-70℃加热。进一步地，步骤3中去末端唾液酸反应的条件为不高于45℃加热。以上所述的肺癌监测试剂盒可以用于检测包含有寡糖链成分的血液或所有人体体液。有益效果：本发明的肺癌监测试剂盒基于检测血液糖蛋白中寡糖链的指纹图谱作为诊断指标对肺癌患者进行了评估，以诊断肺癌的肿瘤分期。该检测方法可以让众多肺癌患者接受常规、无创检测，帮助医生检测肺癌，并能够及时监测疾病进展。附图说明图1为实施例1中采用血清的n-寡糖链指纹技术分析的流程示意图；图2为实施例1中采用的人血清g-test图谱；图3为实施例1中健康对照组的血清g-test图谱；图4为实施例1中肺癌患者的血清g-test图谱。具体实施方式下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。研究发现，血液糖蛋白的糖苷键连接的碳水化合物含量的改变与肺癌患者的组织学之间存在显著地相关性。进一步地，评估肺癌临床监测方法可有效筛查、定期评估肺癌的进展以及治疗后肿瘤的复发。在本发明中，采用血清的寡糖链指纹技术（简称g-test方法）作为诊断指标对肺癌患者进行了评估。该方法主要步骤是，释放并荧光标记血清或血浆样品中的糖蛋白的寡糖链；分离测量样本中荧光标记的寡糖链的含量或指纹图谱（简称g-test图谱）；分析比较寡糖指纹图谱，得到检测指标参数，具体流程见图1。该方法可以让众多肺癌患者接受常规、无创检测，帮助医生检测肺癌，并能够及时监测疾病的发生和发病的进展。具体地，用于监测患肺癌或肺癌风险的组合物选自下述的寡糖链：na3f、na2f、na2fb、nga2f、nga2fb以及na3。以下实施例中，利用(na3f+na2fb)/na3的比值来诊断肺癌检测。如图2所示，人血清的g-test图谱大概显示出近10个n-寡糖链峰，不同的寡糖链因分子大小的不同而表现出不同的迁移性，即表现在g-test图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链；寡糖链的相对浓度含量则表现在所测出的峰高。上述寡糖缩写分别表示为：nga2f，半乳糖缺失含核心岩藻糖(α1，6fuc)的两天线；nga2fb，半乳糖缺失带有二等分乙酰葡糖胺(g1cnac)修饰的核心岩藻糖(α1，6fuc)两天线；ng1a2f，半乳糖单一缺失的核心岩藻糖(α1，6fuc)两天线(singleagalacto，core-α-1，6-fucosylatedbiantennary)；na2，两天线(bigalacto，biantennary)；na2f，核心岩藻糖(α1，6fuc)两天线；na2fb，带有二等分乙酰葡糖胺(glcnac)修饰的核心岩藻糖(α1，6fuc)两天线；na3，三天线；na3f，分支岩藻糖(α1，3/1，2fuc)修饰的三天线。本发明提供的一种肺癌监测试剂盒由以下试剂组成：试剂a（变性缓冲液）：10mm的碳酸氢铵5%sds；试剂b（糖苷外切酶反应缓冲液）：糖苷外切酶终浓度2.2单位/μl在3.33%np40；试剂c（apts标记缓冲液）：混和同等体积的20mmapts（溶于1.2m柠檬酸）和1m有机物还原剂（溶于dmso）；试剂d（唾液酸酶反应液）：0.25μl100mmnh4ac，ph5；0.2μl唾液酸酶，2.55μl双氧水。在本发明中，有机物还原剂优选nacnbh3。实施例1一、测试样本本实验共收集了21例肺癌患者的血清，血清收集来自镇江第一人民医院。健康对照组57例的血清来自镇江第一人民医院。以上21例患者均接受临床实验室分析诊断和组织学检查并符合以下选择标准：(a)均为肺癌感染的患者；(b)排除人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)等其他病毒感染；(c)血清采集均在患者未接受任何治疗之前，临床血常规、生化、肿瘤标志物、dna载量等数据与血清同期收集。以上数据用于评估病人的肺功能损害的程度。二、设备和试剂设备主要是abi测序仪(appliedbiosystems美国生物应用公司)，以及与之作用原理相同的毛细管电泳仪试剂主要含有试剂a（变性缓冲液）：10mm的碳酸氢铵5%sds；试剂b（糖苷外切酶反应缓冲液）：糖苷外切酶终浓度2.2单位/μl在3.33%np40；试剂c（apts标记缓冲液）：混和同等体积的20mmapts（溶于1.2m柠檬酸）和1mnacnbh3（溶于dmso）；试剂d（唾液酸酶反应液）：0.25μl100mmnh4ac；0.2μl唾液酸酶，2.55μl双氧水。三、检测血清样本中的g-test图谱的操作步骤g-test图谱分析的操作程序包括四个步骤：步骤1，用专一性的n-糖苷键水解酶制备自由寡糖链：往稀释一倍的4μl血清加入2μl的试剂a，95℃加热5分钟变性，然后同等体积的（4μl）的试剂b，37℃反应3小时后干燥；步骤2，荧光标记自由寡糖链：在步骤1的液体中加入2μl的试剂c，65℃加热3小时进行荧光标记，然后加入200μl的水终止标记反应；步骤3，去除末端唾液酸：取2μl荧光标记的步骤2的液体，然后加入2μl的试剂d，45℃加热3小时进行去末端唾液酸反应，然后加入200μl的水终止标记反应；步骤4，分离分析荧光标记的n-寡糖链：取10μl步骤3所得去末端唾液酸反应的液体，用abi3500dx测序仪进行n-寡糖链片分离，得到g-test图谱。检测分析：对测量得到的g-test图谱中的每个峰均进行量化计算，以每个峰的相对含量来表示(%)：即用每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和来定量计算，计算得到g-test值。用统计学比较肺癌患者与健康对照组的相对含量的差异，具体结果如下表所示：g-test值nga2fnga2fbng1a2fng1a2fna2na2fna2fbna3na3f(na2fb+na3f)/na3正常组57例6.750.955.495.4848.5215.924.489.922.490.75肺癌组21例7.981.124.775.3348.4913.287.276.365.401.99人血清的g-test图谱代表不同的n-寡糖链峰，因分子大小的不同而表现出不同的迁移性，即表现在g-test图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链；寡糖链的相对浓度含量则表现在所测出的峰高。如图3和图4所示，肺癌组与正常对照组的na2fb，带有二等分乙酰葡糖胺(glcnac)修饰的核心岩藻糖(α1，6fuc)两天线；na3，三天线；na3f，分支岩藻糖(α1，3/1，2fuc)修饰的三天线有着明显差距，血液糖蛋白的n-糖苷键连接的碳水化合物(n-寡糖)含量的改变与肺癌患者的组织学之间存在显著地相关性。研究发现利用(na3f+na2fb)/na3的比值来诊断肺癌检测效果显著，设定(na3f+na2fb)/na3的阈值小于1时为正常组，正常组57例中有49例满足要求，准确度为85.9%。判定(na3f+na2fb)/na3的阈值大于1.5时为肺癌组，肺癌组21例有19例满足要求，准确度为90.5%。结果说明血液糖蛋白的n-糖苷键连接的碳水化合物(n-寡糖)含量的改变与肺癌患者的组织学之间存在显著地相关性。当前第1页12