一种铂‑三维石墨烯气凝胶基酶传感器件的制备及应用的制作方法

本发明具体涉及一种铂-三维石墨烯气凝胶基酶传感器件的制备及应用，属于电化学传感器领域。

背景技术：

基于氧化还原酶直接电子转移的电化学生物传感器由于优良的选择性、灵敏度和方便性引起了极大关注，在药品质控、临床诊断和食品分析等领域得到广泛应用。然而，在制备酶传感器时需要解决两个关键问题：一是在电极如何有效固定酶且不变性；二是如何加快氧化还原酶和电极之间的电子转移速率。由于大多数蛋白质的氧化还原中心深深埋在多肽链内部，直接电化学通常很难实现。

辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，hrp）是一种典型的血红素酶，具有比活性高，稳定性好，分子量小，纯酶容易制备等特点，其直接电化学行为的研究对于研究生命体内的电子转移过程，了解生命过程的氧化还原机理及建立高灵敏的检测方法等具有重要意义。选择合适的材料应用于电化学生物传感界面设计对于实现蛋白质直接电化学具有重要影响，许多纳米材料具有高表面积和良好的生物相容性，如金属纳米粒子，金属硫化物，金属氧化物和碳材料，已被用于固定生物酶分子。纳米铂是一种具有较高催化活性的贵金属纳米材料，常用于电化学、电池等领域。石墨烯是单层石墨紧密排列所形成的蜂窝状二维空间材料，具有比表面积大、机械强度高、热导性高、导电性好等独特的性质，在高性能电子器件、复合材料、传感器及能量存储等领域具有重要应用，但是石墨烯纳米片易发生团聚进而限制了其应用范围。三维石墨烯是以石墨烯纳米片为基本单元构建的石墨烯宏观体，具有比表面积大，孔洞结构明显，导电性能优越等特点，为其制造宏观器件打下了良好的基础。开发一种基于三维石墨烯的三维复合材料并用于构建酶传感器，对于实现蛋白质酶的直接电化学及其催化应用具有重要意义。

技术实现要素：

针对以上现状，本发明公开一种铂-三维石墨烯气凝胶基酶传感器件的构建方法及应用，不仅可以解决二维石墨烯纳米片易团聚的缺点，还可以增大电极有效面积，提高导电性，增加活性位点，提高蛋白质在电极表面的固定量，易于实现蛋白质的直接电化学。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种铂-三维石墨烯气凝胶基酶传感器件的制备及应用，包括以下步骤：

（1）将氯铂酸与氧化石墨烯水溶液进行超声处理得混合液；

（2）将步骤（1）所述的混合液进行水热法处理，得圆柱形铂-三维石墨烯水凝胶；

（3）将步骤（2）中铂-三维石墨烯水凝胶进行干燥得铂-三维石墨烯气凝胶；

（4）奖步骤（3）制得的铂-三维石墨烯气凝胶与辣根过氧化物酶水溶液混合均匀，滴涂于电极表面，晾干后再滴涂nafion溶液，自然晾干后即得铂-三维石墨烯气凝胶基酶传感器；

（5）将步骤（4）制得的铂-三维石墨烯气凝胶基酶传感器应用于三氯乙酸的电催化性能研究。

步骤（1）所述的氯铂酸浓度为0.1~2.0mg/ml，氧化石墨烯水溶液浓度为0.5~5.0mg/ml；

优选的，所述的氯铂酸浓度为1.0mg/ml，氧化石墨烯水溶液浓度为2.0mg/ml。

步骤（2）中所述的水热法中高压反应釜的体积为20~100ml，温度为120~180℃，反应时间为10~12小时；

优选的，所述的水热法为高压反应釜的体积为50ml，温度为180℃，反应时间为12小时。

步骤（3）中所述的干燥方法为冷冻干燥法，具体为-87℃下冷冻干燥8~15小时。

优选的，所述冷冻干燥时间为12小时。

步骤（4）所述铂-三维石墨烯气凝胶与辣根过氧化物酶水溶液为含有浓度为0.1~2.0mg/ml的铂-三维石墨烯气凝胶材料，浓度为10.0~20.0mg/ml辣根过氧化物酶；

优选的，所述铂-三维石墨烯气凝胶与辣根过氧化物酶水溶液为含有浓度为1.0mg/ml的铂-三维石墨烯气凝胶材料，浓度为15.0mg/ml辣根过氧化物酶。

步骤（4）所述的电极为正己基吡啶六氟磷酸盐（hppf6）为修饰剂和粘合剂制备的碳糊电极（cile），其制备方法为：将石墨粉和正己基吡啶六氟磷酸盐的质量比为2：1混合，放入研钵中研磨均匀，滴加适量液体石蜡，将混合物充分研磨，把研磨好的混合物填入直径为4毫米的玻璃电极管中，内插铜丝作为导线，将玻璃管电极中的固体混合物压实即得cile，使用前将电极表面打磨成镜面；

优选的，所述的离子液体碳糊电极取石墨粉1.6g和hppf60.8g。

步骤（4）所述的铂-三维石墨烯气凝胶与辣根过氧化物酶混合溶液的滴涂用量为6~10μl；

优选的，所述的铂-三维石墨烯气凝胶与辣根过氧化物酶混合溶液的滴涂用量为8.0μl。

步骤（4）所述的nafion溶液为0.5%nafion无水乙醇溶液，滴涂用量为6.0~10.0μl；

优选的，所述的0.5%nafion无水乙醇溶液，滴涂用量为8.0μl。

步骤（5）所述的铂-三维石墨烯气凝胶基酶传感器（nafion/pt-3dgr-hrp/cile）应用于三氯乙酸（tca）的电催化性能研究，所用方法为循环伏安法，扫速为20~800mv/s；电解质溶液为ph2.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液（pbs），pbs除氧用气体为氮气、氩气等；样品测试液为医用换肤用35%的tca溶液；

优选的，所述的循环伏安法扫速为100mv/s，电解质溶液为ph7.0的磷酸盐缓冲溶液。

本发明的有益效果：

1.按照本发明方法所得铂-三维石墨烯气凝胶具有丰富多孔的结构，孔径范围为10～20μm，铂纳米粒子尺寸50～100nm；具有比表面积大，导电性优良，生物相容性好等优点。

2.按照本发明方法所得nafion/pt-3dgr-hrp/cile具有成本较低，工艺过程简单，步骤少，操作容易等优点；

3.结果表明所得nafion/pt-3dgr-hrp/cile可用于三氯乙酸的直接电化学测定，且具有催化活性高，稳定性好，灵敏度高，线性范围宽等优点。

附图说明：

图1为本发明实施例制备铂-三维石墨烯气凝胶的sem图（a、b）；（c）铂-三维石墨烯气凝胶tem图；（d）pt-3dga-hrp的sem图；

图2为hrp和pt-3dga-hrp的红外光谱图（a）和紫外-可见吸收光谱图（b）；

图3（a）为不同修饰电极在10.0mmol/lk3[fe(cn)6]和0.1mol/lkcl混合溶液中的循环伏安图；（b）为不同修饰电极在1.0mmol/lk3[fe(cn)6]和0.5mol/lkcl的电化学交流阻抗谱图；（a-d曲线对应的修饰电极分别为cile，nafion/cile，nafion/hrp/cile，nafion/pt-3dga-hrp/cile）

图4为不同修饰电极在直接电化学溶液中的循环伏安图；（a-d曲线对应的修饰电极分别为nafion/cile，nafion/pt-3dga/cile，nafion/hrp/cile，nafion/pt-3dga-hrp/cile）

图5（a）为不同扫速下nafion/pt-3dgr-hrp/cile的循环伏安图；（b）为氧化峰电流（ipa）和还原峰电流（ipc）与扫速的关系曲线；（c）为氧化峰电位（epa）和还原峰电位（epc）与扫速的对数lnυ之间的关系；（a-m曲线对应的扫速分别为100,150,200,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900mv/s）

图6为nafion/pt-3dgr-hrp/cile在不同ph缓冲溶液的循环伏安图；（a-f曲线对应的ph为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）

图7（a）为nafion/pt-3dgr-hrp/cile在存在不同浓度三氯乙酸下的循环伏安图（a-k对应三氯乙酸浓度分别为0，1，3，5，7，10，14，20，26，32，40mmol/l）；（b）为nafion/pt-3dgr-hrp/cile电催化还原三氯乙酸的工作曲线

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步说明。

实施例1铂-三维石墨烯复合材料气凝胶的制备

铂-三维石墨烯气凝胶（pt-3dga）合成的方法如下：将20mg的氯铂酸溶于0.2ml蒸馏水，超声20min后，与20ml2.0mg/ml的氧化石墨烯水溶液混合，超声1h后转入50ml的高压反应釜中于180℃加热12h，室温冷却得到圆柱形pt-3dgr水凝胶，用水和乙醇清洗三次后在-87℃冷冻干燥12h，即得pt-3dga。

实施例2铂-三维石墨烯复合材料气凝胶的形貌表征

图1a和b为pt-3dga在不同放大倍数下的扫描电子显微镜图（sem），可以看出pt-3dga为三维联通的多孔结构，孔径约为10μm，其表面及内部孔洞中均匀分散有pt纳米粒子（ptnps）。采用透射扫描电镜技术对pt-3dga的表征结果如图1c所示，可以清晰的看到石墨烯呈薄片立体状且有很多褶皱，ptnps大小均匀呈面心立方体，ptnps在石墨烯褶皱处分散相对比较多，说明褶皱促进了ptnps的附着。

实施例3铂-三维石墨烯气凝胶基酶传感器件的构建

将8.0μl15.0mg/mlhrp和0.2mg/mlpt-3dga混合液滴涂到离子液体碳糊电极（cile）表面，在室温下晾干后将8.0μl0.5%nafion溶液滴涂到上述修饰电极的表面，在室温下自然晾干后即可得到所要制备的酶传感器（nafion/pt-3dga-hrp/cile），放在4°c冰箱保存。

实施例4pt-3dga-hrp复合物的表征

（1）形貌表征

图1d为pt-3dga-hrp复合物在电极表面的sem图，可以看出hrp-pt-3dga在修饰电极表面仍能保持很好的三维孔洞结构，且hrp均匀的覆盖于pt-3dga表面及内部，形成一层膜，这有利于hrp电化学活性中心血红素辅基与纳米材料的紧密接触，增加活性中心与电极之间的电子传递的机率，为实现其直接电化学提供了条件；

（2）光谱表征

图2为hrp及pt-3dga-hrp复合膜的傅立叶变换红外光谱图，从图中可以看出hrp结构中酰胺i和酰胺ii的红外吸收带分别为1650cm^-1和1540cm^-1与hrp在pt-3dga-hrp复合膜中（1651cm^-1和1540cm^-1）的位置相同（图2a），吸收谱带的一致性表明hrp在复合膜没有发生构象变化；

hrp在pt-3dga-hrp混合溶液中紫外可吸收光谱曲线如图2b所示。从图中可以看出，hrp在水中的soret吸收带在401.0nm；与在pt-3dga-hrp混合溶液中hrp的soret吸收带处于相同位置，表明hrp在pt-3dga-hrp混合溶液中保持了其原始结构没有发生变化。

实施例5修饰电极的电化学性质

图3a为不同修饰电极在10.0mmol/l[fe(cn)6]^3-/4-和0.1mol/lkcl混合溶液中循环伏安图。在cile（曲线a）上有一对明显的准可逆的氧化还原峰；而在nafion/cile（曲线b）上氧化还原峰电流减小，是由于非导电高分子膜nafion的存在阻碍了电子的传递。在nafion/hrp/cile（曲线c）上氧化还原电流相比nafion/cile（曲线b）进一步减小，这是由于生物大分子hrp的存在进一步阻碍了电极表面的电子传递速率。在nafion/pt-3dga-hrp/cile（曲线d）上氧化还原电流明显增大，这是由于pt-3dga的存在增大了电子转移速率。pt-3dga纳米复合材料具有大的比表面积、高的导电性和电子迁移率等独特的性质，其在电极表面的存在增大了电极的比表面积，加快了铁氰化钾的电子转移；

图3b为不同修饰电极在10.0mmol/l[fe(cn)6]^3-/4-和0.1mol/lkcl混合溶液的电化学交流阻抗谱图。在cile上（ret）值为80.8ω（曲线a），涂敷nafion后其ret值增大至120.1ω（曲线b），加入hrp后ret值进一步增大至184.4ω（曲线c）。因此nafion和hrp分子在电极表面的存在均阻碍了铁氰化钾的电子传递速率。在nafion/pt-3dga-hrp/cile的ret值降低33.2ω（曲线d），说明电极表面pt-3dga纳米材料的存在可以增大表面积和电导率，降低了界面电阻，加快了[fe(cn)6]^3-/4-的电子转移。

实施例6hrp的直接电化学行为

不同修饰电极在ph7.0pbs缓冲溶液中的电化学行为如图4所示。可以观察到在nafion/cile（曲线a）和nafion/pt-3dga/cile（曲线b）上没有明显的氧化还原峰出现。在nafion/hrp/cile（曲线c）出现一对不对称氧化还原峰，表明hrp和cile之间存在直接电子转移但速率缓慢，这是由于cile已经表现出一定的电导率与较好的生物相容性，适用于蛋白质直接转移电子过程。hrp修饰电极表面加入pt-3dga后氧化还原峰电流明显增加，峰形状变得更加对称（曲线d）。从曲线d得到还原峰电位（epc）和氧化峰峰电位（epa）分别为-0.307v和-0.229v，峰电位差（δep）为78mv，式电位（e^0′）为-0.268v（vs.sce），为hrp中血红素辅基fe(iii)/fe(ii)氧化还原电对的特征峰。电极表面的pt-3dga为三维空洞结构，表面积大，可以负载更多的hrp，并作为hrp和电极之间的直接电子转移提供良好界面与传递的桥梁，进而加快电子转移速率。

实施例7扫描速度的影响

扫描速度（υ）对hrp修饰电极的电化学影响如图5a所示。在不同的循环伏安扫描速度下均可以出现一对峰形对称的氧化还原峰，且氧化还原峰电流基本相等。在扫速从100~900mv/s范围内氧化还原峰电流与扫描速度呈好线性关系（图5b），线性回归方程分别为ipc(μa)=4.87+80.83υ(v/s)(γ=0.997)和ipa(μa)=-1.71-64.19υ(v/s)(γ=0.996)，表明为一个典型的表面控制的薄层电化学行为，说明在该扫速范围内电极反应是吸附控制的过程。根据方程q=nfaγ*，其中γ*为电活性物质的表面浓度，f为法拉第常数，a为电极面积，q为积分电量，基于此方程γ*值计算为8.97×10^-10mol/cm²，而固定在电极表面的总量计算为2.38×10^-8mol/cm²，因此电极表面有3.77%的hrp分子参加了电极反应。随着扫描速度的增加，氧化还原峰电位峰差也逐渐增加的。如图5c所示，ep和lnυ之间呈良好的线性关系，线性回归方程分别为epc(v)=-0.0437lnυ-0.361(γ=0.993)和epa(v)=0.0398lnυ-0.2046(γ=0.991)。根据laviron方程可以求出电子传递系数（α）为0.52，反应速率常数（ks）为3.35s^-1。

实施例8ph值的影响

nafion/hrp-pt-3dga/cile在ph3.0到8.0范围内的循环伏安响应如图6a所示。随ph值的增加，氧化还原峰电位向负电位的方向移动，表明有质子参与电化学反应过程。当缓冲溶液ph大于8时峰形开始变形，而在ph值为7.0时氧化还原峰电流最大且峰形最好，因此本实验所采用的最适ph值为7.0。式电位（e^0′）和ph值之间具有良好的线性回归关系（图6b），方程为e^0′(v)=-0.0501ph+0.0566(γ=0.993)，斜率值-50.1mv/ph接近理论值-59.0mv/ph。

实施例9nafion/pt-3dga-hrp/cile对三氯乙酸的电催化行为

nafion/pt-3dgr-hrp/cile对三氯乙酸（tca）的电催化行为的循环伏安曲线如图7a所示。在ph7.0的pbs中加入tca后，在-0.17v附近出现还原峰，且随着tca加入量的增大，还原峰电流明显增大而氧化峰逐渐减小。在tca浓度为0.5mmol/l到40.0mmol/l范围内，催化还原峰电流与tca浓度呈良好的线性关系（图7b），线性回归方程为ip（μa）=1.451c（mmol/l）+0.464（n=17,γ=0.998），检出限为0.17mmol/l（3σ）。

实施例10nafion/hrp-pt-3dgr/cile的分析应用

为验证nafion/hrp-pt-3dgr/cile对tca的检测应用，采用标准加入法对tca药物溶液（35%）中tca的含量进行测定。取0.3ml35%tca用ph7.0pbs稀释至10ml作为样品，采用实验方法进行测定，结果如表1所示，回收率在96.40%~101.75%范围内，相对标准偏差（rsd）小于3%，表明该传感器件可用于tca的含量分析，在tca实际样品检测中具有良好的应用前景；

表135%tca药物溶液中tca的检测结果（n=3）

实施例11nafion/pt-3dgr-hrp/cile的稳定性和重现性

考察了nafion/pt-3dgr-hrp/cile在ph7.0的pbs缓冲溶液中的循环伏安曲线，持续扫描50圈后，峰电流依然能保持起始峰电流的98.54%，持续扫描200圈后，峰电流与原来相比降低了8.4%，这说明nafion/pt-3dgr-hrp/cile在pbs中的稳定性较好。修饰电极在4ºc冰箱中存放两周之后的峰电流能保持起始值的95.28%；存放30天后峰电流仍可保持起始值的87.52%。平行制备5根相同的nafion/pt-3dgr-hrp/cile对重现性进行了研究，修饰电极对20.0mmol/l的tca进行测定，结果相对标准偏差（rsd）为2.35%，表明修饰电极nafion/pt-3dgr-hrp/cile具有较好的制备重现性。