一种基于高内涵技术定量分析烟碱致细胞DNA损伤的方法与流程

本发明属于dna损伤体外检测技术领域，更具体而言，本发明涉及烟碱致细胞dna损伤的体外定量分析方法。

背景技术：

烟碱是烟草制品和烟气中的一种致瘾性物质，可以引起心血管疾病及生殖毒性。虽然目前人们一般认为烟碱并不是一种致癌物，但是其可能是一种致癌增强剂。烟碱暴露大鼠的外周血细胞的微核化细胞显著增多；体外实验表明烟碱可以通过氧化应激方式导致dna链的断裂。目前世界卫生组织烟草控制框架公约(fctc)将烟碱列为烟气优先级管制污染物之一。此外，烟碱是n-亚硝基降烟碱等亚硝胺类物质的前体物质，其在体内可能会转化成具有致癌性的亚硝胺类物质。所以，准确检测烟碱对细胞dna的损伤对于烟碱的遗传毒性和危害性评价具有重要的意义。

dna双链断裂是dna最严重的一种损伤形式，如果这种损伤不能被正确或者及时修复就可能会导致染色体畸变或者细胞凋亡等。作为dna双链断裂的一种生物标志物，磷酸化组蛋白γh2ax已经被广泛地应用于临床医药学、放射学及毒理学等研究方面。包括很多单体化合物和混合物通过γh2ax实验对其遗传毒性进行了测定和评价。例如，tanaka等利用γh2ax实验对卷烟烟气冷凝物的遗传毒性进行了检测和评价；smart等采用γh2ax实验对依托泊苷、米托蒽醌及甲基亚硝脲的dna双链断裂的剂量-效应关系进行了研究。该实验因其灵敏性高、结合其他仪器检测技术可以进行大规模分析检测，拥有其他遗传毒性检测技术并不具备的多种优点，目前已经被广泛地应用于化合物和有毒物质的遗传毒性筛选和评价。

目前对γh2ax进行分析检测的主要方法有流式细胞仪、elisa(酶联免疫吸附试验)、westernblot(蛋白质印迹)、显微镜技术等。流式细胞仪和westernblot操作繁琐，检测前需要将贴壁细胞酶解成单细胞悬液，破坏了细胞的结构和功能完整性，且检测通量较低。elisa不能提供细胞内荧光焦点的分布情况且需要额外添加其他检测蛋白对结果进行校正，而显微镜技术的检测通量低，且人为计数的误差较大。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种无需破坏细胞、简单、有效且灵敏度高的烟碱致dna损伤的定量分析方法，该方法的检测结果准确并且可视化，以克服现有技术的缺陷。

本发明的目的通过将高内涵技术和γh2ax的定量分析相结合而实现。具体而言，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于高内涵技术定量分析烟碱致细胞dna损伤的方法，所述方法包括以下步骤：

1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；

2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含烟碱和细胞培养液；

3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γh2ax的免疫荧光标记与细胞核的dapi染色；

4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γh2ax的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γh2ax的含量。

优选地，所述步骤1)中，所述细胞为贴壁生长细胞；更优选地，接种时，所述细胞处于对数生长期，以单细胞悬液接种于细胞培养液中；

更优选地，细胞接种后将细胞在细胞培养液中于37℃，5％co2条件下培养24h。

优选地，所述步骤2)中，所述细胞染毒液中烟碱的浓度为0-500μg/ml，优选>0且≤500μg/ml，更优选为15.63-500μg/ml；

根据本发明的具体实施方式，所述细胞染毒液中烟碱的浓度可以是0、15.63、31.25、61.5、125、250或500μg/ml。

优选地，在所述细胞染毒液中培养细胞1-24h、优选24h。

优选地，所述步骤3)包括：

3-1)吸弃所述细胞染毒液，洗涤细胞，加入多聚甲醛进行细胞固定；

3-2)洗涤细胞，然后加入triton-100x以使细胞通透；

3-3)洗涤细胞，然后加入血清白蛋白封闭，之后加入一抗即抗γh2ax抗体进行孵育；

3-4)洗涤细胞，然后加入免疫荧光标记的二抗进行孵育；

3-5)洗涤细胞，加入dapi进行染色；

3-6)洗涤细胞，保存。

优选地，所述步骤4)中，所述细胞的细胞核和γh2ax的荧光测定分别在两组不同的激发波长和发射波长下进行；

优选地，所述步骤3-4)中，免疫荧光标记的二抗为alexafluor488标记的二抗，并且所述步骤4)中，在通道一中以激发波长358nm和发射波长461nm进行细胞核的荧光测定，在通道二中以激发波长495nm和发射波长519nm进行γh2ax的荧光测定，以获得通道一所识别的有效细胞的有效细胞核内通道二所检测的平均荧光强度，由此表征γh2ax的含量；

更优选地，在两个通道中，测量倍数为200倍，每孔分析和测定9个视野。

根据本发明的具体实施方式，步骤4)采用高内涵细胞分析系统进行，例如购自thermoscientific的型号为arrayscanvti600的高内涵细胞分析系统。

任选地，本发明的方法还包括，设置在步骤3-3)中没有加入一抗、仅在步骤3-4)中加入二抗的空白对照组，从而在步骤4)中得到由非特异吸附引起的空白信号，由此从检测到的荧光测定信号中扣除空白信号。

本发明的方法还可包括剂量-效应曲线的绘制。即，通过在步骤2)中设置多种包含不同浓度的烟碱的细胞染毒液，进行所述方法，最后根据γh2ax的平均荧光强度和烟碱的浓度绘制剂量-效应曲线。

或者，本发明的方法还可包括时间-效应曲线的绘制。即，通过在步骤2)中将细胞在包含相同浓度的烟碱的细胞染毒液中培养不同时间，进行所述方法，最后根据γh2ax的平均荧光强度和培养时间绘制时间-效应曲线。

根据本发明的具体实施方式，当细胞为人肺癌细胞株a549时，可以如下进行本发明的方法：

1)细胞培养：采用含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培养液于37℃、5％co2条件下在培养箱中培养人肺癌细胞株a549，当细胞汇合率达到70-80％时，采用0.25％的胰蛋白酶进行消化后获得单细胞悬液，然后以每孔100μl浓度为10⁵个细胞/ml的接种量接种于96孔细胞培养板，在含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培养液中于37℃，5％co2条件下培养24h。

2)细胞染毒：吸弃培养24h后的细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液为分别包含0、15.63、31.25、61.5、125、250、500μg/ml烟碱的步骤1)中的细胞培养液。浓度组至少设置两组空白对照，空白对照组仅添加含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培养液，于37℃，5％co2的条件下培养24h。

3)免疫荧光标记：

3-1)吸弃细胞染毒液，每孔加入100μlpbs(磷酸盐缓冲液，ph7.2～7.4；全文同)洗涤细胞两次，每次至少5min；然后每孔加入50μl4％的多聚甲醛溶液在室温下固定15min；

3-2)固定好的细胞再用pbs洗涤两次，每次至少5min；然后加入50μl0.5％的triton-100x溶液(在pbs中)于室温下通透15min；

3-3)通透后的细胞再用pbs洗涤两次，每次至少5min；然后每孔加入3％bsa封闭液(在pbs中)于37℃下封闭1h，之后加入50μl含有小鼠抗人γh2ax抗体溶液(1:200，v/v)，一组空白孔中仅加入50μl1％bsa作为阴性对照孔，另一组空白孔加入50μl含有小鼠抗人γh2ax抗体溶液作为空白对照孔，孵育条件为：37℃下恒温孵育2h或者4℃过夜；

3-4)一抗孵育后的细胞再用pbs洗涤三次，每次至少5min；然后每孔加入50μlalexafluro488标记的山羊抗小鼠抗体溶液(1:200，v/v)于37℃下避光孵育2h；

3-5)二抗孵育后的细胞再用pbs洗涤三次，每次至少5min；然后加入50μl1μg/ml的dapi(在pbs中)在室温下染核10min；

3-6)pbs洗涤三次后，每孔加入100μlpbs，4℃避光保存，待测。

4)高内涵技术定量分析：通道一(细胞核荧光测定)设置激发波长和发射波长分别为358nm和461nm，通道二(目标物γh2ax的荧光测定)设置激发波长和发射波长分别为495nm和519nm，测量倍数为200，每孔分析和测定9个视野，以通道一所识别的有效细胞的有效细胞核内通道二所检测的平均荧光强度表征γh2ax的含量。

5)数据处理：设置在步骤3-3)中没有加入一抗、仅在步骤3-4)中加入二抗的空白对照组，在步骤4)中所检测信号即为由非特异吸附引起的空白信号，从所有样品测试孔的检测信号中扣除空白信号；最后根据目标物γh2ax的荧光强度和烟碱的浓度绘制剂量-效应曲线。

参见图1，本发明提供了一种基于高内涵技术来定量分析烟碱致细胞dna损伤的方法，克服了现有烟碱体外染毒和dna损伤检测方法的不足。具体而言，本发明提供了一种评估染毒毒物为烟碱时所导致的dna双链断裂情况的方法，其中磷酸化组蛋白γh2ax作为烟碱诱导的dna双链断裂的生物标志物，并且采用高内涵技术对γh2ax进行检测，提高了检测效率和灵敏度。在本发明的方法中，细胞在暴露烟碱后，通过细胞免疫荧光染色γh2ax和高内涵自动成像与分析实现了细胞样本的直接、高通量检测。

与现有技术相比，本发明的方法还具有如下优良效果：

1)本发明的方法可以在细胞培养板中进行，例如96孔板，因此所需细胞量和样品量少，可同时对96个样本进行检测，检测通量更高；

2)检测前无需破坏细胞，也无需酶解制备单细胞悬液或提取蛋白，所以样本处理更为简单和快捷；

3)高内涵技术具有高分辨率的成像获取功能，因此γh2ax在细胞核内的分布可直接观测，且图像资料也便于存储以备再分析；

4)通过细胞核识别，可对每个细胞核内荧光标记的γh2ax进行定量分析，所以检测结果更为灵敏和准确。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了本发明方法的流程图。

图2示出了烟碱诱导a549细胞产生γh2ax的剂量-效应曲线，其中细胞染毒液中没有添加代谢活化系统大鼠肝s9。

图3示出了烟碱诱导a549细胞产生γh2ax的剂量-效应曲线，其中细胞染毒液中添加代谢活化系统大鼠肝s9。

图4示出了烟碱诱导a549细胞产生γh2ax的时间-效应曲线。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

一抗：小鼠抗人γh2ax抗体，购自biolegend，货号613402；

使用时配制成溶液：取100μl小鼠抗人γh2ax抗体加入1％的bsa溶液中，1:200(v/v)稀释，充分混匀。

二抗：alexafluro488标记的山羊抗小鼠抗体，购自武汉珈源量子点公司，货号ym002；

使用时配制成溶液：取100μlalexafluro488标记的山羊抗小鼠抗体加入pbs溶液中，1:200(v/v)稀释，充分混匀。

大鼠肝s9溶液：购自moltox，货号11-101.1。

使用时配制成10％s9混合物：由4体积溶液a、60体积溶液b、16体积溶液c、10体积溶液d与10体积大鼠肝s9溶液混合而成，其中溶液a含有0.2mol/l的mgcl2和0.825mol/l的kcl；溶液b含有0.176mol/l的na2h2po4和0.024mol/l的nah2po4；溶液c含有0.025mol/l的nadp。溶液d含有0.05mol/l的葡萄糖-6-磷酸盐；溶液a-d均采用去离子水配制。

高内涵细胞分析系统，购自thermoscientific，型号arrayscanvti600。

实施例1

在细胞染毒液中没有添加代谢活化系统大鼠肝s9时，测定烟碱暴露24h后诱导的γh2ax。

收集处于对数生长期的a549细胞，以每孔10000个细胞种植于96孔板，在含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培养液中于37℃，5％co2培养箱孵育24h。

吸弃培养24h后的细胞培养液，用分别含有0、15.63、31.25、62.5、125、250及500μg/ml烟碱的细胞培养液(同样是含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培养液)作为细胞染毒液，继续培养细胞24h。

染毒结束后吸弃细胞染毒液，每孔加入100μlpbs洗涤两次，每次至少5min；然后每孔加入50μl4％的多聚甲醛溶液在室温下固定15min；固定好的细胞用pbs缓冲液洗涤两次，每次至少5min；然后每孔加入50μl0.5％的triton-100x溶液室温下通透15min；通透后的细胞用pbs洗涤两次，每次至少5min；然后每孔加入3％bsa封闭液(在pbs中)于37℃下封闭1h，之后每个样品孔加入50μl含有小鼠抗人γh2ax抗体溶液(1:200，v/v)，一组空白孔中仅加入50μl1％bsa作为阴性对照孔，另一组空白孔加入50μl含有小鼠抗人γh2ax抗体溶液作为空白对照孔。孵育条件为：37℃下恒温孵育2h或者4℃过夜；一抗孵育后的细胞用pbs洗涤三次，每次至少5min；然后每孔加入50μlalexafluro488标记的山羊抗小鼠抗体溶液(1:200，v/v)于37℃下避光孵育2h；二抗孵育后的细胞再用pbs洗涤三次，每次至少5min；然后每孔加入50μl1μg/ml的dapi(在pbs中)在室温下避光染核10min；pbs洗涤三次后，每孔加入100μlpbs，4℃避光保存。

自动聚焦后，设置高内涵细胞分析系统的通道一(细胞核荧光测定)的激发波长和发射波长分别为358nm和461nm，设置通道二(目标物γh2ax的荧光测定)的激发波长和发射波长分别为495nm和519nm，测量倍数为200倍，每孔分析和测定9个视野，γh2ax以通道一所识别的有效细胞的有效细胞核内通道二所测定的平均荧光强度进行表征。

试验中设置空白对照组，即没有加入一抗，仅加入荧光标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异吸附引起的空白信号；所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号；最后根据目标物γh2ax的荧光强度和烟碱的浓度绘制剂量-效应曲线。

图2所示为不同浓度的烟碱在染毒24h后诱导a549细胞产生的γh2ax的剂量-效应关系曲线。由图可知，随着烟碱浓度的升高，a549细胞产生的γh2ax逐渐增多，呈现出显著的剂量-效应关系。当烟碱的浓度为500μg/ml时，细胞内产生的γh2ax超过正常组(即烟碱浓度为0时)的1.5倍。

实施例2

在细胞染毒液中添加代谢活化系统大鼠肝s9时，测定烟碱暴露24h后诱导的γh2ax。

实验过程按照实施例1所述进行，唯一的区别是，细胞染毒液除包含细胞培养液与烟碱之外，与10％s9混合物混合，使得细胞染毒液中含有1％s9混合物。

图3所示为细胞染毒液中添加1％s9后，不同浓度的烟碱在染毒24h后诱导a549细胞产生的γh2ax的剂量-效应关系曲线。如图可知，随着染毒浓度的增大，细胞内产生的γh2ax先下降后再升高。

细胞染毒液中添加s9可以增强烟碱在体外的代谢转化，因此添加体外代谢活化系统s9可以避免体外测试中由于细胞代谢能力的不足而导致的测试结果为假阴性的可能。因此，通过添加和不添加s9可以更准确地了解烟碱在体外对细胞dna损伤的诱导，并由此证明了本发明的方法是客观、可用的。

实施例3

在细胞染毒液中没有添加代谢活化系统大鼠肝s9时，测定500μg/ml烟碱分别暴露1、2、4、8、12和24h后诱导的γh2ax。

实验过程按照实施例1所述进行，唯一的区别是，烟碱在细胞染毒液中的浓度固定在浓度500μg/ml，染毒时间分别为1、2、4、8、12和24h。

图4所示为500μg/ml的烟碱在染毒1、2、4、8、12和24h后诱导a549细胞产生的γh2ax的时间-效应关系曲线。由图可知，随着染毒时间增加，a549细胞产生的γh2ax逐渐增多，呈现出显著的时间-效应关系。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。