一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法与流程

本发明涉及分析技术领域，具体涉及一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法。

背景技术：

熊去氧胆酸(ursodexycholic acid)是一种亲水胆汁酸，在生理情况下，熊去氧胆酸占人体胆汁酸的比例不超过2％。研究表明，熊去氧胆酸能有效溶解胆固醇性结石，有利胆、保护肝细胞和免疫调节等作用，长期服用能够增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解，可明显缓解症状，改善脂肪肝影像学表现，用于不宜手术治疗的胆固醇结石，对脂肪肝具有较好疗效，而且不良反应轻，使用安全；对结肠癌化疗引起的腹泻、预防和治疗肝移植术后急性排斥反应、各种肝病的辅助治疗、胆汁返流性胃炎和原发性胆汁性肝硬化的治疗等有较好疗效，被广泛用于临床多种肝胆疾病的治疗。

由于液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)法可以克服背景干扰，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度，且具有分辨率高、质量范围宽、扫描快等优点，LC-MS/MS已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。为此本发明建立了一种快速、灵敏的LC-MS/MS方法定量检测人血浆中熊去氧胆酸的浓度，并将该方法应用于熊去氧胆酸的药物代谢动力学研究，为熊去氧胆酸的临床研究奠定技术基础。因此建立熊去氧胆酸的LC-MS/MS分析方法，有助于服务制药企业，缩短其一致性评价的研究周期，高效严谨便捷准确的进行样品分析。使老百姓吃到安全，有效又便宜的药。

建立通用、简单、快捷、准确的熊去氧胆酸血浆样品分析定量检测方法，有助于准确快速的研究该化合物的药代动力学特征，获得相应的PK参数，为熊去氧胆酸的一致性评价建立基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，该方法采用沉淀前处理、LC-MS/MS质谱仪进行测定，操作简单、分离效果好、定性准确、样品分析时间短、检测灵敏度高。

本发明的技术方案为：一种人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取熊去氧胆酸对照品至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为2～10mg·mL-1的熊去氧胆酸储备液，将所述熊去氧胆酸储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为0.1～5000μg·mL-1的熊去氧胆酸工作溶液；称取一定量的内标熊去氧胆酸-d4至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为0.300～0.800mg·mL-1的内标储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成200～600ng·mL-1的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在0～10℃下保存，备用；

(2)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μL人血浆样品，向样品中加入步骤(1)所述的内标工作溶液，然后加入乙腈沉淀剂，涡旋混合，于3～8℃的离心机中高速离心3～5分钟；取上清液并向上清液中加入体积比1:1的甲醇水溶液，涡旋混合3～5分钟，进行LC-MS/MS分析；

(3)标准及曲线配制过程：等量取步骤(1)所述各浓度熊去氧胆酸工作溶液，分别加入到犬空白血浆中涡旋混匀，配制成校正标样及随行质控样品，然后分别注入LC-MS/MS中进行测定，以熊去氧胆酸和内标熊去氧胆酸-d4的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中熊去氧胆酸的浓度为横坐标制作标准曲线；

(4)LC-MS/MS测定过程：根据标准曲线计算人血浆样品中的熊去氧胆酸浓度。

进一步地，所述LC-MS/MS测定过程工作条件为：

a.液相色谱条件：色谱柱为UItimateXB C18；流动相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸铵的水溶液；流动相B：乙腈；柱温箱温度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；色谱柱平衡状态时的柱压：20.0～24.0MPa；洗脱方式为梯度洗脱；

b.质谱条件：离子源为ESI源，采用负离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：-5000～-4000V；涡旋离子喷雾温度：550～650℃；气帘气种类：30psi；碰撞池气体：中级；雾化气种类Gas1：40psi；辅助气Gas 2：50psi；数据收集时间：3～6min。

优选地，步骤(2)所述离心机转速≥10000×g。

优选地，所述LC-MS/MS测定过程中熊去氧胆酸的监测离子对为391.2/391.2，每次扫描一个离子对时所停留的时间200msec，去簇电压-137eV，碰撞能量-5.00eV。

优选地，所述LC-MS/MS测定过程中内标熊去氧胆酸-d4的监测离子对为395.3/395.3，每次扫描一个离子对时所停留的时间100msec，去簇电压-32.0eV，碰撞能量-13.0eV。

优选地，步骤(3)所述校正标样有8～10个，浓度为20.0～20000ng·mL^-1。

优选地，步骤(3)所述随行质控样品由低、中、高及DQC的四个浓度组成；其中所述DQC随行质控样品浓度为10000ng·mL-1，稀释因子为10。

进一步地，所述色谱条件还包括：自动进样器清洗溶液为甲醇，压脚提升量：48mm；自动进样器温度：4.0℃；自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；自动进样器洗针体积：400μL；自动进样器进样针清洗时浸泡时间：2seconds；自动进样器进样体积：15.0μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明采用多反应监测模式进行定性和定量，能够有效提高定性准确度和方法的灵敏度，最低检测限可达到纳克级水平，分析时间短，所需样品量更少；2、本发明在人血浆样品中加入乙腈沉淀剂，较传统固相萃取前处理方法，操作更简单，处理速度快，引进误差小，分离效果好，检测效率高；3、本发明利用校正标样及随行质控样品确定标准曲线，提高了检测的精密度和准确度，确保定性定量分析结果可靠。

附图说明

图1：人血浆中熊去氧胆酸浓度测定的代表性标准曲线

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实验耗材与仪器：

分析天平：BT125D十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司

离心机：Thermo FisherSorvall Legend Micr 17R高速离心机，美国赛默飞世尔

超声清洗器：KQ5200E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司

移液器：0.5-10μL，2-20μL，20-200μL，100-1000μL，Eppendorf

玻璃样品瓶及螺旋盖：3.0mL，5.0mL，7.0mL，10.0mL，20.0mL，30.0mL，60.0mL，100mL，南通叠泰实验仪器有限公司

96孔深孔板：P-DW-20-C，2.00mL，美国爱思进公司(AXYGEN)

96孔深孔板密封垫：P-DW-20-C，2.00mL，美国爱思进公司(AXYGEN)

聚丙烯离心管：1.5mL，海克拉斯实验器材有限公司

高效液相色谱泵：LC-20ADXR，Shimadzu公司

自动进样器：SIL-20ACXR，Shimadzu公司

柱温箱：CTO-20AC，Shimadzu公司

质谱仪：QTRAP4500，ABSciex公司

实施例

人血浆中熊去氧胆酸浓度LC-MS/MS测定方法的建立：

(1)标准工作溶液的配制：分别精密称取两份一定量的熊去氧胆酸对照品至玻璃瓶中，精密加入一定体积的甲醇配制成浓度为5.00mg·mL-1的储备液，标记为S01-1与S01-2。称取一定量的熊去氧胆酸-d4(内标)至玻璃瓶中，精密加入一定体积的甲醇，配制成浓度为0.500mg·mL-1的内标储备液；所有储备液保存在6℃冰箱中，备用；将配制好的熊去氧胆酸储备液用体积比1：1的甲醇水溶液逐级稀释成浓度为500、400、250、50.0、20.0、5.00、1.00和0.500μg·mL-1的熊去氧胆酸工作溶液，用于配制校正标样；将平行称量配制的另一份熊去氧胆酸储备液逐级稀释成浓度为2500、375、25.0和1.50μg·mL-1的熊去氧胆酸工作溶液，用于配制质控样品。用体积比1：1的甲醇水溶液将熊去氧胆酸-d4(内标)储备液稀释成400ng·mL-1的内标工作溶液；所有的工作溶液保存在6℃冰箱中，备用。

(2)血浆样品前处理过程：取40.0μL人血浆样品，加入20.0μL内标工作溶液，然后加入300μL乙腈沉淀剂，涡旋混合5分钟，样品于4℃的离心机中以10000×g离心5分钟。转移100μL上清液至装有100μL体积比1：1的甲醇水溶液的96孔板中，涡旋混合5分钟，进行LC-MS/MS分析；

(3)标准及曲线配制过程：取10.0μL步骤(1)所述熊去氧胆酸工作溶液，加入到240μL犬空白血浆中，涡旋混匀，配制成20000、16000、10000、2000、800、200、40.0和20.0ng·mL-1的校正标样，及100000ng·mL-1、15000ng·mL-1(HQC)、1000ng·mL-1(MQC)和60.0ng·mL-1(LQC)的质控样品，取20.0μL 100000ng·mL-1的质控样品加入到180μL的犬空白血浆中，配制成10000ng·mL-1的DQC样品，用以考察稀释可靠性；将校正标样及随行质控样品，分别注入LC-MS/MS中进行测定。熊去氧胆酸和内标熊去氧胆酸-d4的色谱图采集和色谱峰积分由软件Analyst1.6.2(AB Sciex)进行处理，分别以熊去氧胆酸和内标熊去氧胆酸-d4的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法以血浆中熊去氧胆酸的浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归，所得的回归方程(Y＝a+bX)即为标准曲线，根据标准曲线计算人血浆样品中的熊去氧胆酸浓度。

(4)LC-MS/MS测定过程工作条件为：

a.液相色谱条件：

色谱柱：UItimateXB C18(50.0×2.1mm，1.70μm，Welch，China)

流动相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸铵的水溶液

流动相B：乙腈

自动进样器清洗溶液：甲醇

柱温箱温度：40℃

流速：0.4mL/min

色谱柱平衡状态时的柱压：22.0MPa(Typical)

自动进样器温度：4.0℃

压脚提升量：48mm

自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗

自动进样器洗针体积：400μL

自动进样器进样针清洗时浸泡时间：2seconds

自动进样器进样体积：15.0μL

洗脱梯度：

b.质谱条件：

离子化模式：负离子模式，Electrospray Ionization(ESI)

扫描模式：多反应监测(MRM)

电喷雾电压：-4500V

涡旋离子喷雾温度：600℃

气帘气种类：氮气 设置：30

碰撞池气体种类：氮气 设置：中级

雾化气种类：氮气 设置：40

辅助气种类：氮气 设置：50

喷针位置：Y＝5.00mm X＝5.00mm

数据收集时间：4.5minutes

*注明：停留时间，此处指的是在监测离子对时，每次扫描一个离子对时所停留的时间。

(5)分析结果：以熊去氧胆酸和内标熊去氧胆酸-d4的峰面积比为纵坐标，人血浆中熊去氧胆酸的浓度(ng·mL-1)为横坐标进行线性回归。熊去氧胆酸的代表性标准曲线y＝0.00518x+0.0586(r＝0.9974)(如附图1)，结果表明熊去氧胆酸在10.0～10000ng·mL-1范围内线性良好。

应用例

本应用例对上述实施例中LC-MS/MS方法测定人血浆中熊去氧胆酸浓度的准确度、精密度进行评价。取20.0μL上述DQC、HQC、MQC、LQC四个浓度的质控样品各一份，按上述方法操作，于1日内每个浓度5个样品重复测定5次，并分别在不同天连续测定3个分析批，计算精密度，结果如下表所示：

本发明人血浆中熊去氧胆酸的定量检测方法各项指标均符合生物样品分析测定要求，采用本发明能够高效、严谨、便捷、准确的进行样品分析，获得相应的PK参数，缩短熊去氧胆酸一致性评价的研究周期，研究人血浆中熊去氧胆酸的药代动力学特征，更好地为制药企业服务，使老百姓吃到安全、有效又便宜的药。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。