Arl13b蛋白在癌症诊断中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及基因诊断。

背景技术：

随着人类生活环境、生活水平和生活方式的变化，恶性肿瘤成为日益常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。全球每年新发癌症1400多万例，其中较为常见的是肺癌、乳腺癌；每年全球有820万人死于癌症，最常见的死因为肺癌。癌症发病地图显示，虽然我国癌症发病率在为全球中等水平，为2.8％，但死亡率却处于中等偏上水平，为27％。我国癌症的发病情况具有一定特点：肝癌发病为50.5％，死亡率为51.4％，均占全球肝癌发病、死亡的一半；食管癌、胃癌同样占全球发病、死亡的近50％；肺癌比例较高，约占全球新发病例1/3。globocan对全球癌症发病、死亡进行预测，到2020年，预计约1714万人将罹患癌症，1005万人将死于癌症。

虽然近年来癌症病人不断增加，但是癌症的五年生存率显著提高。与1995年-1999年相比，我国2005年-2009年主要癌症的5年生存率得到了较明显的提高，比如：胃癌由15.3％增加至31.3％，结肠癌由33.5％增加至54.6％，直肠癌由28.9％增加至53.2％，肝癌由2.4％增加至12.5％，肺癌由7.5％增加至17.5％，乳腺癌由53.8％增加至80.9％，宫颈癌由40.1％增加至59.9％。治疗技术进步如手术技术水平的提高；先进的化疗药物和放疗技术的应用和越来越多的高效靶向药物的发现等是癌症治愈率提高的一个重要原因。但是人们更多地将其归功于对癌症病灶的早发现、早诊断和早治疗。

arl13b是一个小分子gtp酶，其特异性地在多种器官的初级纤毛中聚集。arl13b对初级纤毛的形成和功能的发挥起着非常关键的作用，参与囊泡运输、细胞分化、细胞运动和细胞骨架形成等过程。在arl13b蛋白缺失的情况下，纤毛短小且结构受损。在人类中，arl13b基因的突变会导致joubert综合症。arl13b基因缺失的小鼠有纤毛结构受损和hedgehog信号通路活性异常等现象，并表现出与joubert综合症病人相似的症状。近期，有文献报道arl13b调节肿瘤细胞的生长。

因此，研究发明出对于癌症的准确和特异性的诊断试剂或试剂盒有迫切的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供能够准确诊断癌症的指标、诊断试剂或试剂盒、arl13b蛋白的诊断试剂盒的用途，以及体外检测其表达量的方法。

本发明的一个目的是，提供了一种癌症诊断的指标。

本发明的第二个目的是，提供了一种癌症诊断试剂盒。在该方面的一个优选例中，抗arl13b抗体偶联有可检测基团，可检测基团选自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。

本发明的第三个目的是，提供了一种癌症诊断试剂盒。在该方面的一个优选例中，含有arl13b蛋白特异性的核酸探针偶联有可检测基团，可检测基团选自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。

本发明的第四个目的是，arl13b蛋白或其核酸序列在制备诊断试剂或试剂盒的用途。在该方面的一个优选例中，癌症诊断试剂是抗arl13b蛋白特异性抗体或arl13b蛋白特异性核酸探针。

本发明的第五个目的是，提供了一种体外检测特异性arl13b蛋白表达的方法，包括：用抗arl13b蛋白特异性抗体或arl13b特异性核酸探针与细胞样品反应，以正常细胞为对照；比较抗体或探针的结合量，其中高于对照的量表明该细胞为癌细胞，低于或等于对照的量表明该细胞为正常细胞。在该方面的一个优选例中，结合量是通过检测与探针或抗体偶联的可检测基团测得的。

本发明具有以下优点：(1)arl13b作为肿瘤的标志物，可用于肿瘤的病情诊断和预后判断；(2)arl13b可作为肿瘤的潜在的治疗靶点。

附图说明

图1为沉默arl13b对肿瘤细胞增殖能力的影响。

图2为过表达arl13b对肿瘤细胞增殖能力的影响。

图3为沉默arl13b对肿瘤细胞侵袭能力的影响。

图4为过表达arl13b对肿瘤细胞侵袭能力的影响。

图5为沉默arl13b对肿瘤细胞迁移能力的影响。

图6为过表达arl13b对肿瘤细胞迁移能力的影响。

图7为arl13b沉默抑制胃癌细胞在裸鼠体内的生长。

图8为arl13b过表达促进胃癌细胞在裸鼠体内的生长。

图9为westernbolt法检测胃癌组织与癌旁组织中arl13b的表达量。

图10为kaplan–meier生存分析不同程度arl13b的表达与总生存期和无疾病生存期的关系。

以上图中，n-shh：n-shh刺激液；control：对照培养基；vector：对照胃癌细胞；arl13b-kd：稳定胃癌细胞mkn45；gapdh：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

具体实施方式

下面将提供实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于举例说明本发明，而不应被视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。

实施例1：平板克隆法检测arl13b对肿瘤细胞增殖能力的影响。

取对数生长期的arl13b沉默的稳定胃癌细胞mkn45(arl13b-kd)和对照胃癌细胞(vector)或过表达arl13b的稳定胃癌细胞mkn28(arl13b)和对照胃癌细胞(vector)，去除培养基，加胰酶充分消化2-3min后加入500μl含10％血清的dmem高糖培养基中和胰酶，吹打混匀细胞，使细胞分离成单细胞。取1000个细胞/孔接种到6孔板中，加n-shh刺激液(n-shh)或对照培养基(control)，并使细胞均匀分散。放置于37℃，5％co2培养箱中培养14-20天。当观察到肉眼可见的克隆时，终止培养。除去培养基，加4％多聚甲醛溶液37℃固定10min。除去固定液后，经pbs洗涤3次后，加入0.2％的结晶紫染色20-30min。pbs多次洗去染色液至pbs澄清后置于空气干燥。将6孔板倒置于专业扫描仪进行扫描。使用imagej软件去除背景并对单位面积(1cm²)的结晶紫染色克隆数进行计算，**表示p<0.01。结果表明，arl13b促进肿瘤细胞的增殖(图1，图2)。

实施例2：transwell实验检测arl13b对肿瘤细胞侵袭能力的影响。

肿瘤细胞经饥饿处理12h。用50mg/lmatrigel1：8稀释液包被transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/lbsa的无血清培养液，37℃，30min。将transwell小室放入24孔板中，在上室加入300μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。消化arl13b沉默的稳定胃癌细胞mkn45(arl13b-kd)和对照胃癌细胞(vector)或过表达arl13b的稳定胃癌细胞mkn28(arl13b)和对照胃癌细胞(vector)，终止消化后离心弃去培养液，用pbs洗1－2遍，用含bsa的无血清培养基重悬，调整细胞密度至1－10×10⁵。取细胞悬液200μl加入transwell小室，24孔板下室加入500μl含20％fbs的培养基，加n-shh刺激液(n-shh)或对照培养基(control)，培养24h。将小室转移至新的培养孔中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面的细胞。往小室内加入100μlpbs，倒置显微镜观察穿过去的细胞，200×光镜下计数10个视野的侵袭细胞数，取其平均值，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力，**表示p<0.01。结果显示，arl13b促进肿瘤细胞的侵袭(图3，图4)。

实施例3：migration实验检测arl13b对肿瘤细胞迁移能力的影响。

用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在孔中加入约5×10⁵个arl13b沉默的稳定胃癌细胞mkn45(arl13b-kd)和对照胃癌细胞(vector)或过表达arl13b的稳定胃癌细胞mkn28(arl13b)和对照胃癌细胞(vector)，，接种原则为过夜后融合率达到100％。第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)。pbs洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清的n-shh刺激液(n-shh)或无血清对照培养基(control)。放入37℃5％co2培养箱，培养。可按0，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)。使用imagej软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值，**表示p<0.01。结果表明，arl13b促进肿瘤细胞的迁移(图5，图6)。

实施例4：arl13b促进胃癌细胞在体内的生长。

购买24只balb/c-nu雌性裸鼠，4-6周龄，体重18-22g；通过随机数字表将24只裸鼠分为两组：①慢病毒沉默对照组(vector)+arl13b沉默组(arl13b-kd)；②慢病毒过表达对照组(vector)+arl13b过表达组(arl13b)；并称量每只裸鼠的体重。用0.25％胰蛋白酶消化arl13b沉默的稳定胃癌细胞mkn45(arl13b-kd)和对照胃癌细胞(vector)或过表达arl13b的稳定胃癌细胞mkn28(arl13b)和对照胃癌细胞(vector)，1000r/min离心，pbs洗涤2次，用pbs配制约i×10⁸细胞/ml。用带6号针头的注射器抽取0.2ml含2×10⁷个活细胞的细胞悬液，接种于每只裸鼠的大腿内侧皮肤(左右分别为对照组，干扰或过表达组)。注射后第七天时，对照组和处理组瘤体大致相等时开始实施引用水中加入多西环素(2mg/ml)诱导表达，每2天换水一次，给药3-4周:每三天用游标卡尺测量一次移植瘤的体积(v)：v＝a×b²/2(a为长径，b为短径)，并观察裸鼠精神、活动情况等生理指标的变化。3-4周后，麻醉无痛处死裸鼠，切取移植瘤，并称量其重量。与对照组(vector)相比，稳定下调arl13b组(arl13b-kd)小鼠的瘤体更小，瘤重更轻(图7)。然而，与对照组(vector)相比，在稳定过表达arl13b组(arl13b)实验中，我们观察到过表达arl13b后瘤体更大，瘤重更重(图8)。

实施例5：检测胃癌组织与癌旁组织中arl13b的表达量。

准备好碎冰，5ml离心管称重并做好标记，与pbs一起冰上预冷。随机取8例胃癌病人的癌组织及其对应的癌旁组织组织冻存管用装有液氮的保温杯转移，剪取部分组织，放入预冷的离心管内，剩余的组织放回冻存管内，放回原处；称重组织，记录；用预冷的pbs洗涤组织，2-3次，洗去粘附的血液；剪碎组织，加入含有1：100蛋白酶抑制剂和1mmpmsf的ripabuffer，加入比例组织：buffer＝1:10(g/ml)；在组织破碎仪上匀浆组织，13000g，10s，至组织较碎；组织要时刻保持在冰上；旋转仪上，4℃旋转30min，使组织充分裂解；裂解液转入ep管，离心，4℃，12000g，15min；取上清，即得所需组织蛋白裂解液；取100μl蛋白定量及做westernblot，其余若暂时不用放-80℃保存。bca蛋白定量，根据所得的数值，定量拟合曲线，得出线性方程和稀释后的蛋白浓度，计算实际的蛋白浓度。取适量的蛋白western上样检测正常组织与癌组织中arl13b的蛋白含量。结果表明arl13b在癌组织中表达量比正常组织高(图9)。

实施例6：arl13b的表达量与胃癌病人的病情和预后相关。

选取的154例胃癌病例中病理保存有石蜡包埋样本，组织类型经1名有经验的病理科医生对入选蜡块来源的组织切片he染色进行确定。对154例胃癌标本(包括154例对应的癌旁组织)进行免疫组化分析。免疫组化评分依照“德国半定量评分系统”进行评分，依照0～12分评分标准，划定0～6分为阴性及低表达，>6分为中高表达。依照arl13b分高低将每个指标评分为两组并与临床病理特征进行性相关性分析。分析结果见表1，结果提示：高表达arl13b与肿瘤大小，浸润深度有关。

为明确arl13b在胃癌组织中高表达对患者预后的影响，我们对纳入研究的患者进行随访。设定观察时间为总生存期(overallsurviva)，及无疾病生存期(disease-freesurvival)。运用kaplan–meier分析进行单因素生存分析发现：arl13b高表达能显著影响患者os及dfs，评分越高患者生存期越短(图10)。表明arl13b与临床预后具有显著的相关性。

表1arl13b与临床病理特征间的关系

综合上述具体实施例测定结果，arl13b在肿瘤组织高表达，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

因此，arl13b蛋白或其核酸序列可被用于制备诊断癌症的试剂或试剂盒。将抗arl13b蛋白特异性抗体或arl13b蛋白特异性核酸探针作为癌症诊断试剂与细胞样品反应，通过检测与探针或抗体偶联的可检测基团获得抗体或探针的结合量，与正常细胞的结合量进行比较，可用于癌症的诊断。