MALDI‑TOFMS技术鉴定临床感染猪肠球菌的方法与流程

本发明涉及细菌检测领域，尤其是公开了一种maldi-tofms技术鉴定临床感染猪肠球菌的方法。

背景技术：

肠球菌为革兰阳性兼性厌氧菌，是动物性食品污染的常见菌之一，近来肠球菌对动物致病性的报道不断增多，尤其是20～70日龄猪常发生一种高热、皮下及实质脏器肿大、出血为主要特征的传染病，以散养和小规模猪群多发，给养猪业造成了严重的经济损失。由于肠球菌对现有抗生素均产生不同程度的耐药性，且抗性基因通过食物链由动物传播给人或在其他细菌之间传递，这使得肠球菌快速准确的鉴定显得尤为重要，并对感染肠球菌的诊断和治疗具有重要意义。

技术实现要素：

本发明克服现有技术存在的不足，提供一种操作简便、快速、准确性高的鉴定临床感染猪肠球菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：maldi-tofms技术鉴定临床感染猪肠球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：采用甲酸提取法对样品进行处理与点样；

1)向1.5mlep离心管中加入300μl去离子水；取待测样本(一个菌落)5-10mg至离心管中；充分混匀；加入900μl无水乙醇，充分混匀；

2)13000rpm离心2min，倒去上清。再次离心，用移液枪完全吸取残余的上清液，整个过程不触碰沉淀。室温下干燥沉淀2-3min。

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混匀；再加入50μl的纯乙腈，充分混匀；13000rpm离心2min，吸取上清置于另一新的离心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室温晾干，再加1μlhcca基质液覆盖样品，室温晾干后上机；

5)分别取等体积的标准肽溶液与基质溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室温晾干，待完全干燥后进行检测，每个样品和标准品各做三个平行孔。

步骤二：利用maldibiotyper高通量微生物鉴定系统对经过步骤一处理的样品进行质谱分析，得到质谱图；

放入已点好样品和校准品的靶板。打开flexcontrol，校准仪器，先用标准品进行系统误差校正，再进行待测样本的质谱分析，通过biotyper软件进行分析鉴定。

步骤三：使用biotyper软件，对得到的质谱图进行分析，得到肠球菌质谱图数据库的标准图谱；

步骤四：将待检测的肠球菌用脑心浸液琼脂培养及分纯，并进行步骤一和步骤二处理；

步骤五：对待检测的肠球菌质谱图进行聚类分析。

所述步骤一具体包括以下步骤：1)向1.5mlep离心管中加入300μl去离子水；取待测样本5-10mg至离心管中；充分混匀；加入900μl无水乙醇，充分混匀；

2)13000rpm离心2min，倒去上清；再次离心，用移液枪完全吸取残余的上清液，整个过程不触碰沉淀；室温下干燥沉淀2-3min；

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混匀；再加入50μl的纯乙腈，充分混匀；13000rpm离心2min，吸取上清置于另一新的离心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室温晾干，再加1μlhcca基质液覆盖样品，室温晾干后上机；

5)分别取等体积的标准肽溶液与基质溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室温晾干，每个样品和标准品各做三个平行孔；所述步骤二具体包括以下步骤：放入已点好样品和校准品的靶板；打开flexcontrol，校准仪器，先用标准品进行系统误差校正，再进行待测样本的质谱分析，通过biotyper软件进行分析鉴定。

所述样品为16srrna确认的临床株；所述标准品为atcc29212粪肠球菌。

所述步骤三具体包括以下步骤：对样品处理与点样，每个平行样品重复点3个样品孔；每个样品孔采集8张质谱图；每个菌株采集24张谱图，共收集到240张并保存；使用biotyper软件，分别调入所采集的每株肠球菌的质谱图，将此质谱图汇总进行分析，该图谱即为肠球菌质谱图数据库的标准图谱。

所述待检测的肠球菌为33株肠球菌临床野生株。

本发明与现有技术相比有以下有益效果：

本发明采用的检测方法与传统和基因型鉴定方法相比，maldi-tofms是基于蛋白指纹图谱的鉴定方法，操作简便、快速、准确性高。本研究从河南不同地区病猪分离的肠球菌，利用maldi-tofms方法鉴定均为粪肠球菌和屎肠球菌，且亲缘关系较近。而粪肠球菌和屎肠球菌是所有肠球菌感染致病中较为常见的菌株，也是医院、食品和猪粪等环境中的优势菌，由于肠球菌具有较强的获得性耐药能力，且在各种环境中生存能力较强，maldi-tofms方法对肠球菌的快速鉴定，可避免菌株的传播和更多耐药菌株的产生，对于兽医临床实践具有重要的意义。

附图说明

图1为肠球菌的主要离子峰图谱；

图2为33株肠球菌的可信度分值；

图3为33株肠球菌指纹图谱的聚类分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本实施例中，10株建库的肠球菌为16srrna确认的临床株，33株建库后验证的肠球菌为临床野生分离株。质控菌株atcc29212为粪肠球菌，以上均为河南农业大学赠送。

实验中用到的甲酸、乙腈、三氟乙酸、无水乙醇都是由fisher公司提供的色谱纯。bts标准品、基质α-氰-4-羟基肉桂酸(hcca)、msp96孔靶由德国bruker公司提供。

革兰阳性细菌鉴定卡(gpi；生产批号：b56k)，购自法国生物梅里埃中国有限公司产品；

脑心浸液琼脂培养基(bhi)(生产批号：160220)购自北京陆桥；maldibiotyper高通量微生物鉴定系统，购自德国brukerdahonics公司，参数设置：线性操作模式，正离子，基质抑制偏转模式。脉冲离子提取时间：100ns。相对分子质量：2000～20000d；

具体鉴定方法包括如下步骤：

步骤一：采用甲酸提取法对样品进行处理与点样；

步骤二：利用maldibiotyper高通量微生物鉴定系统对经过步骤一处理的样品进行质谱分析，得到质谱图；

步骤三：使用biotyper软件，对得到的质谱图进行分析，得到肠球菌质谱图数据库的标准图谱；

步骤四：将待检测的肠球菌用脑心浸液琼脂培养及分纯，并进行步骤一和步骤二处理；

步骤五：对待检测的肠球菌质谱图进行聚类分析。

1.2.1样品处理与点样采用甲酸提取法

1)向1.5mlep离心管中加入300μl去离子水；取待测样本(一个菌落)5-10mg至离心管中。充分混匀；加入900μl无水乙醇，充分混匀；

2)13000rpm离心2min，倒去上清。再次离心，用移液枪完全吸取残余的上清液，整个过程不触碰沉淀。室温下干燥沉淀2-3min；

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混匀；再加入50μl的纯乙腈，充分混匀；13000rpm离心2min，吸取上清置于另一新的离心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室温晾干，再加1μlhcca基质液覆盖样品，室温晾干后上机；

5)分别取等体积的标准肽溶液与基质溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室温晾干，待完全干燥后进行检测，每个样品和标准品各做三个平行孔；

1.2.2数据采集

放入已点好样品和校准品的靶板。打开flexcontrol，校准仪器，先用标准品进行系统误差校正，再进行待测样本的质谱分析，通过biotyper软件进行分析鉴定。

1.2.3建立数据库的方法

按1.2.1.1的方法进行样品处理与点样，每个平行样品重复点3个样品孔。每个样品孔采集8张质谱图。每个菌株采集24张谱图，共收集到240张并保存。使用biotyper软件，分别调入所采集的每株肠球菌的质谱图，将此质谱图汇总(已有数据库和新建数据库)进行分析，该图谱肠球菌质谱图数据库的标准图谱。

1.2.4临床野生株的鉴定

取33株肠球菌临床野生株，用脑心浸液琼脂(bhi)培养及分纯，

参照上述建库时的处理方法，然后上机。

1.2.5结果判断如表1所示为质谱数据判断标准

表1

2结果

2.1建库

经过16srrna确认的10株肠球菌临床株，用于建立maldi-tofms数据库，对10株菌全部进行了数据采集与汇总，建立了标准图谱，最终建成包含10株肠球菌信息的数据库，如图1所示。这10株肠球菌菌株的主要离子峰一致，峰谱稳定；

2.2临床野生株的鉴定

依次将1-33株肠球菌如图2所示，分别进行鉴定，分析与肠球菌数据库中的匹配结果。经maldi-tofms鉴定，33株肠球菌的匹配分值均大于2.300，表明鉴定结果的可信度很高。

2.3肠球菌maldi-tofms质谱聚类分析结果

选取33株肠球菌质谱图进行聚类分析，采用相似分值构建系统树，33株肠球菌聚类分型树状图如图3所示。差异程度0-1000表示菌株之间的同源性程度高低，差异程度越接近1000，表示菌株同源性越低，越接近0时表示菌株同源性越高。经maldi-tofms分析33株肠球菌在差异程度为0.8时分成两个主要的类别，用不同的颜色标示，其中绿色为粪肠球菌共13株，红色为屎肠球菌20株,1号菌株为粪肠球菌atcc29212，与5号菌株同源性最高，与屎肠球菌相比，粪肠球菌的亲缘关系更近一些。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。