一种棉花耐低钾种质的鉴定方法与流程

本发明涉及一种棉花耐低钾种质的鉴定方法，属于棉花种植技术领域。

背景技术：

棉花作为我国重要的经济作物和战略物资，在国民经济中占有很重要的地位(喻树迅等,2000)。但棉花由于生长周期长，生物量大，棉铃钾含量高的生物特性，使其对钾的需求总量很高。然而棉花的根系相对弱小，从土壤中吸收钾素的能力偏低，所以棉花要比其他大田作物对于低钾更为敏感(cassmanetal.,1990；田晓莉等,2008)。近年来，随着棉花复种指数和产量水平的逐步提高，我国棉花生产中的缺钾现象越来越普遍、缺钾程度也越来越严重(yangetal.,2011)。此外，由于不合理的肥料运筹，我国棉花生产中的缺钾现象进一步加剧，常常导致早衰并严重影响产量提高和品质改善(董合忠等,2005)。土壤缺钾以及钾肥短缺已经成为制约我国农业发展的重要限制因素，因此选育钾高效吸收的品种是解决这一问题的有效途径之一。

根系作物吸收养分的主要器官，也是养分进入作物体内的第一道障碍。钾高效基因型一般具有较好的k⁺吸收速率：如发达的根系、高的吸收能力等特点(yangetal.,2011；wangetal.,2012)；如何快速有效的筛选k⁺吸收速率较高的材料，是棉花育种工作的重要工作内容之一。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种棉花耐低钾种质的鉴定方法，该方法利用不同耐低钾性棉花品种在k⁺吸收速率上具有明显差异的性质，采用非损伤微测技术(nmt)快速、准确的鉴定棉花品种的耐低钾性，具有一定的实用价值。

本发明采用的技术方案如下：

一种棉花耐低钾种质的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)将棉花种子平分两部分，分别进行水培培养和蛭石培养各6天；选择生长整齐的幼苗，用刀片分别切取水培条件下幼苗中上部根系及蛭石培养条件下主根根系作为待测样品；

同时，以耐低钾材料中571和钾敏感品种新棉99b分别作为耐低钾对照样品和钾敏感对照样品；

(2)将待测样品及对照样品分别先用去离子水冲洗干净，浸没于蒸馏水中，再浸入测试液中平衡；

(3)将步骤(2)处理好的待测样品及对照样品分别转入新的测试液中，采用非损伤性微测技术(nmt)测定低钾胁迫6天(水培培养)和发苗6天(蛭石培养)棉花幼苗的钾离子流速；

(4)通过比较待测组织样品与对照样品的钾离子流速，判断所述棉花种子是否为耐低钾性较强的棉花种质材料。

其中，各步骤具体条件如下：

步骤(1)中，所述耐低钾材料(中571)和钾敏感品种(新棉99b)均由中国农业科学院棉花研究所提供；

步骤(1)中，水培及蛭石培养条件：在光照(钠灯)培养室内进行，光照强度为450μmolm^-2s^-1，光照时间为14h，白天温度为28±2℃，夜间温度为20±2℃。

步骤(1)中，具体培养方法为：将种子用9％的双氧水消毒30min，清水漂洗数次后种子平分为两部分；

一部分种子均匀播于用去离子水冲洗过的沙床，上面盖一层涤纶布后再覆薄沙一层，4d后将幼苗转移至体积为32cm×26cm×32cm的塑料方盒中，用含k⁺离子为0.1mm改良的hoagland营养液进行低钾胁迫培养，对比排列，每处理重复6盒；

改良的hoagland营养液配方为：2.5mmca(no3)2,1mmmgso4,0.5mm(nh4)h2po4,0.1mmfe-na-edta,0.2μmcuso4,1μmznso4,20μmh3bo3,5pm(nh4)6mo7o24,1μmmnso4和0.1mmkcl。

另一部分种子播种于盛有去离子水洗过蛭石的纸杯中(10cm×12cm)，每天适量喷水保持蛭石的湿度；

步骤(3)中，测试液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmoll^-1mes，ph6.0。

步骤(3)中，测定部位：水培条件下幼苗根系的测定部位距根尖300-600μm，优选300μm处；蛭石培养条件下幼苗的测试部位距根尖600-800μm，优选600μm。

步骤(3)中，待测试环境达到稳定状态后测试时间持续5～8min。

步骤(4)中，所述判断的方法具体为：

a、若待测组织样品的k⁺离子保留或吸收能力显著低于钾敏感品种xm99b，则属于钾极敏感材料；

b、若待测组织样品的k⁺离子保留或吸收能力与钾敏感品种xm99b无显著差异，则属于钾敏感材料；

c、若待测组织样品的k⁺离子保留或吸收能力显著高于钾敏感品种xm99b，而低于耐低钾材料z571，则属于中等耐低钾材料；

d、若待测组织样品的k⁺离子保留或吸收能力与耐低钾材料z571无显著差异，则属于耐低钾材料；

e、若待测组织样品的k⁺离子保留或吸收能力显著高于耐低钾材料z571，则属于强耐低钾材料。

本发明通过测定不同的生长环境中(低钾胁迫水培和蛭石)培养的幼苗根系不同部位的k⁺离子流，建立了一种快速、高效的室内鉴定棉花幼苗钾吸收能力的方法，具有一定的实用价值。

附图说明

图1为低钾胁迫条件下z571与xm99b的耐低钾能力示意图。

图2为低钾胁迫处理对不同棉花幼苗的干物质和钾离子的累积的影响。

图3为低钾胁迫处理6天后不同材料棉花幼苗根中k⁺离子的动态变化。

图4为蛭石中培养6天的幼苗主根中k⁺离子的动态变化。

图5为实施例1中低钾胁迫6天(水培培养)幼苗根系的k⁺离子流。

图6为实施例1中发苗6天(蛭石培养)幼苗根系的k⁺离子流。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

1.材料与方法

供试材料为耐低钾材料中571(z571)和钾敏感品种新棉99b(xm99b)，种子均由中国农业科学院棉花研究所提供；

试验条件：试验在光照(钠灯)培养室内进行，光照强度为450μmolm^-2s^-1，光照时间为14h，白天温度为28℃±2℃，夜间温度为20℃±2℃。

种子用9％的双氧水消毒30min，清水漂洗数次后种子分为两部分。一部分种子均匀播于用去离子水冲洗过的沙床，上面盖一层涤纶布后再覆薄沙一层。4d后将幼苗转移至体积为32cm×26cm×32cm的塑料方盒中，用含k⁺离子为0.1mm改良的hoagland营养液进行低钾胁迫培养，对比排列，每处理重复6盒。

改良的hoagland营养液配方为：2.5mmca(no3)2,1mmmgso4,0.5mm(nh4)h2po4,0.1mmfe-na-edta,0.2μmcuso4,1μmznso4,20μmh3bo3,5pm(nh4)6mo7o24,1μmmnso4和0.1mmkcl。

低钾胁迫处理3天、6天和9天后，测定其干物质累积和钾离子含量；同时低钾胁迫6天后，采用非损伤性微测技术(nmt)测定不同材料的钾离子流速。

另一部分种子播种于盛有去离子水洗过蛭石的纸杯中(10cm×12cm)，每天适量喷水保持蛭石的湿度，发苗6天后，采用非损伤性微测技术(nmt)测定不同材料的钾离子流速。

干物质量和k⁺含量的测定；取待测植株，先用去离子水浸泡10min后，再用蒸馏水冲洗干净，并用吸水纸吸去表面附着的水分。将幼苗根及地上部(茎和叶)分开，分别于105℃杀青30min后，80℃下烘直至恒重，称其干物质量。将烘干后的植株粉碎过筛，用1moll^-1hcl浸提12h并振荡30min后过滤，用原子吸收分光光度计(spectaa-50/55,varian,australia)测定k⁺浓度。

离子流速测定；在旭月(北京)科技有限公司采用非损伤微测技术(bio-001a,youngerusasci.&tech.corp.,amherst,ma,usa)测定幼苗根系k⁺离子流速；选生长整齐的棉花幼苗，用刀片从幼苗根部切取部分根系(～3cm)作为根组织样品；将测定的样品用去离子水冲洗干净，并将其浸没在蒸馏水15min，浸入20ml测试液中平衡15min，再转入新的20ml测试液中开始测试。测试液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmoll^-1mes，ph6.0；每处理测定8株幼苗，测试持续7～10min(达到稳定状态)，计算时舍弃前2～3min的数据。

数据统计；所有实验至少独立重复3次，各次结果趋势一致，取其中具有代表性的数值进行统计分析。采用spss16.0(spssinc.chicago,usa)处理数据，以duncan’s多重比较进行差异显著性检验(p<0.05)。

2.结果与分析

2.1低钾胁迫条件下z571的耐低钾能力要高于xm99b；如图1所示，低钾胁迫20天，钾敏感品种xm99b叶片黄化且出现明显的干枯斑点；而耐低钾材料z571的叶片保持正常的形态。

2.2低钾胁迫处理影响不同棉花幼苗的干物质和钾离子的累积(见图2)。低钾胁迫处理3天和6天，不同材料幼苗的干物质累积无显著差异；低钾胁迫处理9天后，不同材料幼苗的地上部干物质累积无显著差异，但z571的根部干物质累积要显著高于xm99b。低钾胁迫处理3天，不同材料幼苗的钾离子含量无显著差异；但低钾胁迫处理6天和9天后，z571的根部和地上部中钾离子含量均要显著高于xm99b。

2.3进一步明确低钾胁迫对棉花幼苗离子吸收的影响，通过非损伤微测技术(nmt)测定低钾胁迫处理6天后不同材料棉花幼苗根中k⁺离子的动态变化。为明确最佳的测定部位，首先测定了距根尖0-2000μm范围的主根中k⁺离子流的变化情况；如图3所示，棉花幼苗的k⁺离子流呈外排状态，且离根尖越远k⁺离子外排速率越高，但不同材料间k⁺离子速率无显著差异；棉花幼苗的k⁺离子速率在0-600μm范围中外排较低，为此选用距根尖300μm处作为后续工作的测定部位。随后测定了距根尖300μm处的主根和上部侧根中k⁺离子流速；结果表明，主根与测定中k⁺离子均为外排，且侧根中k⁺离子外排速率高于主根中k⁺离子外排速率；不同材料中比较，主根中k⁺离子外排速率品种间无显著差异，而z571的侧根中k⁺离子外排速率显著低于xm99b的侧根，即z571的侧根保留k⁺离子能力强于xm99b的侧根。

2.4与此同时，测定了在蛭石中培养6天的幼苗主根中k⁺离子的动态变化；为明确最佳的测定部位，首先测定了距根尖0-2000μm范围的主根中k⁺离子流的变化情况；如图4所示，棉花幼苗的k⁺离子流呈内流状态，且呈现单峰曲线，其中在600-800μm处k⁺离子流速达最高；不同材料间比较，z571在0-2000μm范围中k⁺离子流速较高，其中在300-1000μm范围中k⁺离子流速要显著高于xm99b的流速。同时，还测定了根毛区(大约距根尖25000μm处)和根毛中k⁺离子的变化；如图4所示，k⁺离子流呈略微外排的状态，但不同的材料间无显著的差异。

3.结论

本研究通过电生理和技术，建立了一种快速、高效的室内鉴定棉花幼苗钾吸收能力的方法。不同的生长环境中(低钾胁迫水培和蛭石)培养的幼苗不同部位根系的k⁺离子流状态有所差别。

在水培条件下，低钾胁迫6天的幼苗根系中k⁺离子呈外排状态，且距根尖在0-600μm范围中k⁺离子外排较低；不同材料间比较，材料间主根中k⁺离子速率无显著差异，而中上部侧根中k⁺离子速率差异显著，即耐低钾的材料保留k⁺离子强于钾敏感品种。

采用蛭石培养6天的幼苗，主根中k⁺离子呈内流状态，呈现单峰曲线，在600-800μm处k⁺离子流速达最高；不同材料间比较，z571在300-1000μm范围中k⁺离子流速要显著高于xm99b的流速；根毛区和根毛中k⁺离子流呈略微外排的状态，但不同的材料间无显著的差异。

本研究证实，利用电生理技术测定低钾胁迫(0.1mmoll^-1)6天的棉花幼苗的上部侧根中k⁺离子流，同时结合在蛭石培养6天的棉花幼苗主根中k⁺离子流的情况，可以快速有效的区分和筛选出耐低钾性较强的棉花种质材料。

实施例1

本实施例提供一种棉花样品的耐低钾性的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)以中571(z571)和新棉99b(xm99b)分别为耐低钾和钾敏感对照，对中棉所41(ccri41)、中棉所45(ccri45)、新陆中61(xlz61)和中51504(z51504)的棉花样品进行鉴定，参试棉花种子均由中国农业科学院棉花研究所提供。

采用非损伤性微测技术(nmt)测定低钾胁迫6天(水培培养)和发苗6天(蛭石培养)棉花幼苗的钾离子流速，培养条件同上文。

选生长整齐的棉花幼苗，用刀片分别切取水培条件下幼苗中上部根系(～3cm)及蛭石培养条件下主根根系(～3cm)作为待测组织样品。

(2)将待测组织样品先用去离子水冲洗干净，再将其浸没在蒸馏水15min，接着浸入20ml测试液中平衡15min；

(3)将步骤(2)处理好的待测组织样品转入新的20ml测试液中，开始测试待测样品的净k离子流；

测试液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmoll^-1mes，ph6.0；

测定部位：水培条件下幼苗根系的测定部位距根尖300μm处，蛭石培养条件下幼苗的测试部位距根尖600μm；

每处理测定8株幼苗，测试持续7～10min(达到稳定状态)，计算时舍弃前2～3min的数据。

(4)结果

a、低钾胁迫6天(水培培养)幼苗根系的k⁺离子呈现外排(图5)；其中，耐低钾材料z571的k⁺离子外排速率显著低于钾敏感品种xm99b；

其它材料间相比，ccri45的k⁺离子外排速率显著高于钾敏感品种xm99b，而ccri41的k⁺离子外排速率与钾敏感品种xm99b无显著差异；z51504和xlz61的k⁺离子外排速率显著低于钾敏感品种xm99b，但与耐低钾材料z571的k⁺离子外排速率无显著差异。

b、发苗6天(蛭石培养)ccri45的幼苗根系的k⁺离子呈现略微的外排状态，而其他材料幼苗根系的k⁺离子则呈现吸收状态(图6)；

其中，钾敏感品种xm99b和ccri41的k⁺离子吸收速率较低，且两材料间无显著差异；而耐低钾材料z571、z51504和xlz61的k⁺离子吸收速率较高，尤其是xlz61的k⁺离子吸收速率最高，要显著高于其他材料。

这些结果表明，不同的材料间保留或吸收k⁺离子的能力有明显的差异，可以通过测定k⁺离子流的结果，快速的判定不同棉花材料间耐低钾能力的差异。以z51504为例，水培培养后，其k⁺离子外排速率显著低于钾敏感品种xm99b，略高于耐低钾材料z571的k⁺离子外排速率，但无显著差异；蛭石培养后，z51504的k⁺离子吸收速率显著高于钾敏感品种xm99b，略高于耐低钾材料z571的k⁺离子吸收速率，但无显著差异；说明了z51504的保留或吸收k⁺离子的能力强于钾敏感品种xm99b，而与z571的保留或吸收k⁺离子的能力相差不大，属于耐低钾材料。

由上述结果可知，测试样品中：

(1)ccri45保留或吸收k⁺离子的能力显著低于钾敏感品种xm99b，属于钾极敏感品种；

(2)ccri41保留或吸收k⁺离子的能力与钾敏感品种xm99b无显著差异，属于钾敏感品种；

(3)z51504保留或吸收k⁺离子的能力与耐低钾材料z571无显著差异，属于耐低钾材料；

(4)xlz61保留或吸收k⁺离子的能力显著高于耐低钾材料z571，属于强耐低钾材料。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。