基于离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片方法和装置与流程

本发明涉及光学成像技术领域，特别涉及离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片显微术。

背景技术：

广泛应用于生物医学、材料学等领域的传统宽场荧光显微镜，由于具有较大的景深，较难获取样品内部三维结构的显微图像。光切片技术，能够获取样品内部结构的三维显微图像，进一步扩展了显微镜的应用范围。目前常用于光切片技术的荧光显微术主要有：扫描共焦荧光显微术[j.pawley,ed.handbookofbiologicalconfocalmicroscopy,3rdedn.(springer,2006)]、结构光照明荧光显微术[r.heintzmann&p.a.benedetti,“high-resolutionimagereconstructioninfluorescencemicroscopywithpatternedexcitation,”appl.opt.45,5037-5045(2006)]、选择平面照明荧光显微术[j.huisken,j.swoger,f.delbene,j.wittbrodt,ande.h.k.stelzer,“opticalsectioningdeepinsideliveembryosbyselectiveplaneilluminationmicroscopy,”science305,1007-1009(2004)]。这些技术各有其优点和局限。

扫描共焦荧光显微术利用照明针孔和探测针孔的共轭物象关系，进行共焦的点照明和点探测成像，也就是使得来自照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点被激发的荧光成像在探测针孔上，该点以外发射的任何荧光均被探测针孔阻挡，通过逐点扫描焦面处的样品层，从而获得比传统荧光显微术更高的轴向分辨率，实现光切片成像。显然，逐点扫描的成像方式耗时，对动态物体成像非常不利，因此，对生物活体的光切片成像有局限性。结构光照明荧光显微术采用结构光照明，照明装置相对复杂。选择平面照明荧光显微术，成像速度较快，但轴向分辨率有限。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片方法，可以提高光切片成像速度。

本发明的另一个目的在于提供一种实现上述方法的装置。

本发明第一个目的通过以下技术方案实现：

一种基于离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片方法，所述方法包括下列步骤：

一个大数值孔径组合物镜和一个管镜构成无限远校正光学系统，组合物镜的物方焦面与管镜的像方焦面形成一对物象共轭面，相机的光敏面设置在管镜的像方焦面；一个光栏设置在组合物镜的像方焦平面，阻挡来自样品的近似平行组合物镜光轴的近轴荧光光束进行成像，允许与组合物镜光轴有夹角的离轴荧光光束进行成像；样品内的一个层面和组合物镜物方焦面重合，激发光源照明样品，样品发射出的荧光被无限远校正光学系统成像，相机拍摄经滤色器过滤后的荧光图像，获得样品内一个层面的光切片；承载样品的样品台在平移器的控制下，带动样品在组合物镜光轴方向移动，使得样品内不同的层面和组合物镜物方焦面重合，相机拍摄图像，获得样品内多个层面的光切片；其中，所述大数值孔径组合物镜的数值孔na的范围：0.75≤na＜2.0。

进一步地，所述物镜和两个中继透镜构成一个组合物镜，两个中继透镜设置在物镜和管镜之间，第一中继透镜的物方焦面和物镜的像方焦平面重合，第二中继透镜的物方焦平面和第一中继透镜的像方焦平面重合，第二中继透镜的像方焦平面为组合物镜的像方焦平面。

进一步地，所述光栏为一圆形，中央有一个不透光圆片，圆片外的环带可透过荧光进行成像。

进一步地，所述光栏为一个可绕光轴旋转的圆形光栏，中央有一个不透光圆片，圆片外的环带中的部分区域可透过荧光进行成像；一个旋转器带动光栏绕光轴旋转，每转动一个相同的角度，相机拍摄一幅图像，旋转一周获得m幅图像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)，利用消除离焦像算法，对这m幅图像进行消除离焦像处理，获得样品内一个层面的光切片图像i(x,y)；其中(x,y)为相机光敏面的像素点坐标。

进一步地，所述消除离焦像算法为将所有图像进行线性叠加：i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)。

本发明另一个目的通过以下技术方案实现：

一种基于离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片装置，所述装置包括：组合物镜、光栏7、管镜2和相机3构成的成像光路，以及激发光源9的激发光路，其中，所述组合物镜由物镜1、第一中继透镜5、第二中继透镜6构成，所述成像光路用于样品荧光成像，所述激发光路用于激发样品发出荧光；激发光源9发出的光束照明样品台4上的样品，被激发出的样品荧光依次经物镜1、第一中继透镜5、第二中继透镜6、光栏7、滤色器11、管镜2成像到管镜像方焦面，设置在管镜像方焦面的相机3拍摄图像；旋转器12驱动光栏7旋转，每旋转一个角度，相机3拍摄一幅图像；样品台4在平移器8的控制下，带动样品在物镜1光轴方向移动，使得样品内的不同层面和物镜1物方焦面重合，相机3拍摄图像；计算机13控制旋转器12、平移器8和相机3之间的联动。

进一步地，所述光栏7，中央有一个不透光圆片，圆片外的环带可透过荧光进行成像，不透光圆片的半径r的范围为：其中fo′为物镜1的像方焦距、f1为第一中继透镜5的焦距、f2为第二中继透镜6的焦距。

进一步地，所述光栏7可绕光轴旋转圆形光栏，中央有一个不透光圆片，不透光圆片的半径r的范围为：不透光圆片的外环带中只有部分区域可透光；透光区域为一透光扇形环，扇形环的圆心角α的范围1°≤α≤90°；透光区域或者为一个偏心透光圆孔，圆孔中心偏离圆形光栏中心的距离d为透光圆孔的半径rt为其中rw为圆形光栏半径。

进一步地，所述激发光源9的激发光路，激发光源9发出的光束经一个二向色镜10进入物镜1，再从物镜1出射照明样品台4上的样品，二向色镜10置于物镜1和第一中继透镜之间；或者激发光源9发出的光束不经物镜1直接照明样品台4上的样品。

进一步地，所述激发光源9发出的光束形成均匀光场照明样品或形成结构光场照明样品。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)扫描共焦荧光显微术是点对点的共焦成像，而本发明是面对面的共焦成像，成像速度更快，方便用于动态样品成像。

(2)相对结构光照明荧光显微术，本发明照明装置简单。

(3)操作简单、方便实用。

附图说明

图1是焦面处的样品层发出的离轴荧光光束，在管镜像方焦面的成像情况；

图2是焦面内的离焦样品层发出的离轴荧光光束，在管镜像方焦面的成像情况；

图3是焦面外的离焦样品层发出的离轴荧光光束，在管镜像方焦面的成像情况；

图4是实施例一中的装置示意图；

图5是实施例二中的装置示意图；

图6是一种旋转对称圆形光栏示意图，黑色表示不透光区域、白色表示透光区域；

图7是一种非旋转对称扇形环光栏示意图，黑色表示不透光区域、白色表示透光区域；

图8是一种非旋转对称偏心圆孔光栏示意图，黑色表示不透光区域、白色表示透光区域；

图中：1-物镜，2-管镜，3-相机，4-样品台，5-第一中继透镜，6-第二中继透镜，7-光栏，8-平移器，9-激发光源，10-二向色镜，11-滤色器，12-旋转器，13-计算机。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

传统荧光显微镜都是利用包含近轴的光束进行成像，轴向可分辨距离一般大于500纳米。为了提高显微成像轴向分辨率，获取光切片，本发明提出采用由物镜和管镜等构成的无限远校正光路系统，利用大倾角偏离光轴的荧光光束进行显微成像，阻挡近轴光束进行成像，偏离光路系统光轴的光束称为离轴光束，近似平行光轴方向的光束称为近轴光束，光束和光轴的夹角称为倾角。相机光敏面置于管镜像方焦面，由于物镜的物方焦面和管镜的像方焦面是物象共轭关系，因此获取的图像是和物镜物方焦面重合的样品层发出的荧光图像。根据成像理论，图1、图2、图3分别给出了样品层处于物镜焦面、焦面内侧、焦面外侧时，在管镜像方焦面的荧光成像情况，图中，相机的光敏面和管镜的像方焦面重合。图1表示焦面处的样品层发出的离轴荧光光束，在管镜像方焦面的成像情况；图2表示焦面内的离焦样品层发出的离轴荧光光束，在管镜像方焦面的成像情况；图3表示焦面外的离焦样品层发出的离轴荧光光束，在管镜像方焦面的成像情况。图1显示，对焦面处的样品层，尽管光栏阻挡了近轴荧光光束的成像，但离轴荧光光束仍然在管镜像方焦面形成一清晰的像，焦面处的样品层面上的一个物点发出的不同方向的离轴荧光光束经光学系统会聚到管镜像方焦面同一点；图2和图3显示，不论在焦面内侧还是在焦面外侧的离焦样品层，其清晰像面不在管镜像方焦面，相机在管镜像方焦面拍摄到的像是模糊的，离焦样品层面上的一个物点发出的不同方向的离轴荧光光束经光学系统会聚到管镜像方焦面不是同一点，是相互错开的，离轴荧光光束的方向、样品物点的离焦量、显微放大倍数(或管镜和物镜的焦距比)都会影响相互错开的程度：荧光光束离轴倾角越大，错开程度越大；物点的离焦距离越大，错开程度也越大；放大倍数越大，错开程度也越大。错开程度越大，离焦样品层面在管镜像方焦面的像就越模糊。根据这一成像特性，本发明在物镜或组合物镜的像方焦面处设置一圆形光栏，光栏中央有一个不透光圆片，圆片外的环带可透过荧光进行成像,这样就限制了近轴荧光光束进行成像，使得离焦样品层在管镜像方焦面处的图像将变得更加模糊甚至消失，图像的轴向分辨率将得到提高，如果光栏为一旋转对称光栏，相机直接拍摄该图像，从而获得光切片；如果设置的圆形光栏是一个非旋转对称的光栏，例如中央有一个不透光圆片，其透光区域不是一个圆形环带，只有圆片外环带中的部分区域可透光，就构成一个非旋转对称的光栏，使得参与成像的离轴荧光光束的方向也是非旋转对称，通过一旋转器驱动光栏绕光轴旋转，每旋转一个角度拍摄一幅图像，旋转一周将拍摄得到多幅图像，由于同一离焦样品层的模糊像在这多幅图像中的位置是不同的，而焦面样品层的清晰像在这多幅图像中的位置却是相同的，根据这一特性，可以利用这多幅图像进行消除离焦像处理，重建得到一幅焦面样品层的光切片图像。消除离焦像的处理算法，可优选：将这多幅图像进行线性叠加得到一幅图像。激发光源发出的光束可以生成均匀光场照明样品，或者生成结构光场照明样品。激发光源生成结构光场照明样品时，需利用图像重建算法，获得光切片图像。

实施例一

如附图4所示，本实施例公开了一种基于离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片装置，依次由物镜1、第一中继透镜5、第二中继透镜6、光栏7、滤色器11、管镜2和相机3构成无限远校正成像光路；第一中继透镜5的物方焦面和物镜1的像方焦平面重合，第二中继透镜6的物方焦平面和第一中继透镜5的像方焦平面重合，物镜1、第一中继透镜5、第二中继透镜6构成组合物镜；激发光源9、二向色镜10、物镜1构成激发光路。激发光源9发出的光束经二向色镜10进入到物镜1，再从物镜1出射照明样品台4上的样品，样品被激发产生荧光；样品发出的荧光依次经物镜1、第一中继透镜5、第二中继透镜6、光栏7、滤色器11和管镜2，最后成像到管镜2像方焦面，相机3的光敏面设置在管镜2的像方焦面。当光栏7选用图6所示旋转对称光栏，相机3拍摄图像，获得样品内一个层面的光切片；当光栏7选用图7或图8所示的非旋转对称光栏，旋转器12驱动光栏7旋转，每旋转一个角度，相机3拍摄一幅图像，旋转一周拍摄到m幅图像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)，利用消除离焦像公式i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，对这m幅图像进行消除离焦像处理，获得样品内一个层面的光切片i(x,y)。样品台4在平移器8的控制下，带动样品在物镜1光轴方向移动，使得样品内不同的层面和物镜1物方焦面重合，相机3拍摄图像，获得样品内多个层面的光切片；计算机13控制旋转器12、平移器8和相机3之间的联动。

实施例二

如附图5所示，本实施例公开了另一种基于离轴光束焦面共轭的荧光成像光切片装置，依次由物镜1、第一中继透镜5、第二中继透镜6、光栏7、滤色器11、管镜2和相机3构成无限远校正成像光路；第一中继透镜5的物方焦面和物镜1的像方焦平面重合，第二中继透镜6的物方焦平面和第一中继透镜5的像方焦平面重合，物镜1、第一中继透镜5、第二中继透镜6构成组合物镜；激发光源9发出的光束直接照明样品台4上的样品，样品被激发产生荧光；样品发出的荧光依次经物镜1、第一中继透镜5、第二中继透镜6、光栏7、滤色器11和管镜2，最后成像到管镜2像方焦面，相机3的光敏面设置在管镜2的像方焦面。当光栏7选用图6所示旋转对称光栏，相机3拍摄图像，获得样品内一个层面的光切片；当光栏7选用图7或图8所示的非旋转对称光栏，旋转器12驱动光栏7旋转，每旋转一个角度，相机3拍摄一幅图像，旋转一周拍摄到m幅图像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)，利用消除离焦像公式i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，对这m幅图像进行消除离焦像处理，获得样品内一个层面的光切片i(x,y)。样品台4在平移器8的控制下，带动样品在物镜1光轴方向移动，使得样品内不同的层面和物镜1物方焦面重合，相机3拍摄图像，获得样品内多个层面的光切片；计算机13控制旋转器12、平移器8和相机3之间的联动。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。