骨桥蛋白用于制备或筛选慢加急性肝衰竭诊断试剂的用途的制作方法

本发明属于生物医学及疾病诊断领域，具体涉及骨桥蛋白用于制备或筛选慢加急性肝衰竭诊断试剂的用途。

背景技术：

骨桥蛋白(osteopontin，opn)是一种多功能蛋白，广泛分布于多种组织和细胞中，在免疫、血管生成、纤维生成以及肿瘤行成等过程中发挥着重要作用。骨桥蛋白通过与其配体整合蛋白、cd44、脂多糖、波形蛋白和myd88作用在细胞内和细胞间的信号转导过程中发挥重要作用，从而调节细胞增殖、迁移、炎症、纤维化以及癌变。目前大量的研究报道了骨桥蛋白在急性肝损伤、非酒精性脂肪肝、酒精肝、肝炎、肝纤维化与肝硬化以及肝癌的疾病发生发展过程中发挥着关键的信号转到作用。

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronicliverfailure，aclf)是在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿。这与慢性肝功能失代偿不同，后者是指在肝硬化基础上，肝功能进行性减退导致的以腹水或门脉高压、凝血功能障碍和肝性脑病等为主要表现的慢性肝功能失代偿。慢加急型肝衰竭主要表现为多器官衰竭，并且伴随着30％以上的28日死亡率和60％以上的90日死亡率(bernalw,jalanr,quagliaa,simpsonk,wendonj,burroughsa.acute-on-chronicliverfailure.lancet2015.)。因此，慢加急性肝衰竭发生早期的及时诊断和治疗对于患者生存至关重要。目前慢加急性肝衰竭的诊断标准仍有争议，clif-cof评分是目前主要诊断标准之一。有研究通过病理切片上存在亚大块坏死区域从失代偿肝硬化患者中区分慢加急性肝衰竭患者。但是以上诊断方法或者复杂耗时、或者有创，对于及时诊断有很大的局限性。因而，发展新的灵敏、快速、高效的辅助慢加急性肝衰竭的诊断或监测疾病进展的方法，对于临床及时诊断和治疗至关重要。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供骨桥蛋白用于制备或筛选慢加急性肝衰竭诊断试剂的用途。

本发明的另一目的在于提供特异性识别骨桥蛋白的试剂在制备慢加急性肝衰竭诊断试剂盒中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种慢加急性肝衰竭诊断试剂盒。

本发明的另一目的在于提供骨桥蛋白作为慢加急性肝衰竭生物标志物的用途。

本发明的另一目的在于提供一种慢加急性肝衰竭诊断方法。

为了实现上述目的及其他相关目的，本发明是采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供骨桥蛋白用于制备或筛选慢加急性肝衰竭诊断试剂的用途。

较优的，所述骨桥蛋白作为生物标志物。

更优的，所述骨桥蛋白作为血清生物标志物。

优选地，骨桥蛋白用于制备或筛选慢加急性肝衰竭诊断试剂，包括两方面的内容：

其一，骨桥蛋白用于制备慢加急性肝衰竭诊断试剂，是指将骨桥蛋白作为慢加急性肝衰竭诊断指标应用于慢加急性肝衰竭诊断试剂的制备。

在一些实施方式中，可将骨桥蛋白作为标准品或阳性对照，用于样本血清中的骨桥蛋白水平的检测。

其二，骨桥蛋白用于筛选慢加急性肝衰竭诊断试剂，是指将骨桥蛋白作为慢加急性肝衰竭的识别靶标筛选特异性识别骨桥蛋白的试剂，从而作为慢加急性肝衰竭诊断试剂，来检测慢加急性肝衰竭。

在一些实施方式中，基于所述的骨桥蛋白筛选特异性结合骨桥蛋白的抗体或配体，从而作为慢加急性肝衰竭诊断试剂。例如，骨桥蛋白酶联免疫试剂盒(购自r&dsystems公司，货号：dost00)中的试剂可以特异性识别骨桥蛋白，因此可以作为慢加急性肝衰竭诊断试剂。

本发明的第二方面，提供了特异性识别骨桥蛋白的试剂在制备慢加急性肝衰竭诊断试剂盒中的用途。

在一些实施方式中，所述特异性识别骨桥蛋白的试剂可以是特异性结合骨桥蛋白的抗体或配体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

例如，骨桥蛋白酶联免疫试剂盒(购自r&dsystems公司，货号：dost00)中的试剂可以特异性识别骨桥蛋白，因此可以作为制备慢加急性肝衰竭诊断试盒。

在本发明的第三方面，提供了一种慢加急性肝衰竭诊断试剂盒，所述的试剂盒中至少含有特异性识别骨桥蛋白的试剂。

在一些实施方式中，所述特异性识别骨桥蛋白的试剂可以是特异性结合骨桥蛋白的抗体或配体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

在一些实施方式中，所述的试剂盒中还含有：免疫结合(如抗原抗体结合)试剂；或酶联免疫检测(elisa)试剂。例如，骨桥蛋白酶联免疫试剂盒(购自r&dsystems公司，货号：dost00)。

在本发明的第四方面，提供了骨桥蛋白作为慢加急性肝衰竭生物标志物的用途。

较优的，所述生物标志物为血清生物标志物。

在本发明的第五方面，提供了一种诊断慢加急性肝衰竭的方法，包括检测样本血清中骨桥蛋白的水平。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明首次揭示了骨桥蛋白能够作为区分慢加急性肝衰竭与否的生物标志物(诊断效果高达0.9454)，明显高于m30(0.7167)、m65(0.8319)和m30/m65(0.8100)，且与临床上常用指标meld(0.9317)几乎持平。

附图说明

图1：骨桥蛋白在慢加急性肝衰竭患者、肝硬化失代偿患者、肝细胞癌患者和正常人血清中的蛋白表达水平的检测。

图2：m30、m65和m30/m65在慢加急性肝衰竭患者和肝硬化失代偿患者血清中的蛋白表达水平的检测。

图3：骨桥蛋白、meld、m30、m65和m30/m65对于诊断慢加急性肝衰竭的受试者工作特征(roc)曲线的绘制。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现与健康人、肝细胞癌患者以及肝硬化失代偿患者相比，慢加急性肝衰竭患者外周血血清中骨桥蛋白含量显著升高，与终末期肝病模型(meld)、总胆红素、肌酐水平呈正相关，及与病程发展和病情严重程度相关。骨桥蛋白可以作为慢加急性肝衰竭的一种诊断标志物，有助于慢加急性肝衰竭的易感性分析、诊断和治疗。根据人骨桥蛋白设计的药物和诊断技术，可用于诊断和治疗人类的慢加急性肝衰竭。在此基础上完成了本发明。

骨桥蛋白及其用途

本发明中全文，所述骨桥蛋白为已知蛋白，英文为osteopontin，简称opn。人骨桥蛋白的蛋白序列可参考genbank：baa03554.1。

现有技术当中，还没有将骨桥蛋白作为慢加急性肝衰竭的分子标记的有关报道。

本发明通过实验发现，骨桥蛋白在慢加急性肝衰竭病人血清中表达量显著高于正常人组。因此，本发明提供了一种骨桥蛋白作为慢加急性肝衰竭标志物的用途。作为本发明的优选方式，骨桥蛋白作为慢加急性肝衰竭的血清检测标志物。血清检测取材方便、操作简单、便于复查，患者易于接受，评估预后，指导治疗。

基于本发明人的上述新发现，可利用骨桥蛋白作为诊断慢加急性肝衰竭的标志物：(i)进行慢加急性肝衰竭的鉴别诊断，和/或易感分析；(ii)评估相关人群的慢加急性肝衰竭治疗药物、药物疗效、患者预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)评估相关人群慢加急性肝衰竭患病风险、检测并进行早期防治。

因此，本发明提供了骨桥蛋白的用途，用于制备或筛选诊断(或检测)慢加急性肝衰竭的试剂或试剂盒。

检测试剂

可采用各种本领域已知的技术来检测骨桥蛋白的存在与否及表达情况，这些技术均包含在发明中。例如，可用已有技术如southern印迹法、wester印迹法等，这些方法可结合使用。

本发明还提供用于在分析物中检测骨桥蛋白的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行蛋白水平的检测时，可采取特异性识别骨桥蛋白的抗体来确定骨桥蛋白的存在与否。

利用特异性结合骨桥蛋白的抗体来检测分析物中骨桥蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。

可以通过本领域内技术人员已知的各种技术制备结合骨桥蛋白的抗体，也可采用商业化的抗体。例如，纯化的骨桥蛋白，可被施用于动物以诱导多克隆抗体产生。与之相似的，表达骨桥蛋白的细胞可用来免疫动物来产生抗体。本发现的抗体也可以是单克隆抗体。此类克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见kohler等人，nature256；495,1975；kohler等人，eur.j.immunol.6:511,1976；hammerling等人，inmonoclonalantibodiesandtcellhybridomas，elsevier，n.y.，1981)。

多克隆抗体的生产可用骨桥蛋白免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

在单克隆抗体或多克隆抗体上标记特异性的可检测信号也是本领域人员已知的技术，例如，可将辣根根过氧化物酶偶联于所述的特异性结合骨桥蛋白的抗体，从而可通过显色反应来得知抗原抗体结合反应的发生与否。

一种检测待测样品中是否存在骨桥蛋白的方法，是采用骨桥蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与骨桥蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在骨桥蛋白。

检测试剂盒

本发明还提供了用于在分析物中检测骨桥蛋白的存在与否以表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性结合骨桥蛋白的抗体或配体。

此外，所述的试剂盒中还可包括免疫结合(抗原抗体结合)试剂或酶联免疫检测(如elisa)试剂等；以及用于杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：杂交液、酶、对照液、显色液、洗涤液等。

本发明的主要优点在于：

本发明通过研究公开了利用血清骨桥蛋白含量诊断和监测慢加急性肝衰竭的临床用途。本发明第一次将检测外周血中骨桥蛋白含量的方法应用于诊断慢加急性肝衰竭，尤其是首次发现检测外周血中骨桥蛋白的含量比前期他人发现的m30、m65、m30/m65三个慢加急性肝衰竭的血清标志更灵敏，进而验证出一种检测外周血中骨桥蛋白含量的方法，作为制备诊断慢加急性肝衰竭的试剂盒。这对临床慢加急性肝衰竭病人的及时诊断和病情监测提供了更为灵敏、高效、稳定的途径。并且本发明人这些创新性的发现，为慢加急性肝衰竭的快速诊断和监测提供了理论基础、新的检测方法，对基础研究和临床应用均有重要的意义。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecμlarcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecμlarbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecμlarbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

实施例1

1.实验方法

收集70例确证慢加急性肝衰竭患者(aclf+)、67例肝硬化失代偿患者(aclf-)、50例肝细胞癌患者(hcc)、30例正常人(health)的外周血样品，各份血液样品收集在凝血管中，体积为5ml左右，5000rpm离心10min，吸取上层澄清的血清。通过elisa试剂盒检测血清中骨桥蛋白、m30、m65的浓度(骨桥蛋白酶联免疫试剂盒购自r&dsystems公司，货号：dost00；m30、m65酶联免疫试剂盒购自vlvbio公司，货号分别为nr.10011和nr.10040)，meld、总胆红素及肌酐浓度由病人病史资料得到。利用graphpadprism6.0软件进行roc曲线绘制，对组间比较用mann-whitney检验，对相关性分析用spearman相关性检验。p<0.05认为有显著差异。

2.实验结果及分析

血清中骨桥蛋白的水平及各组间的比较见图1。

由图1可知，慢加急性肝衰竭患者血清中骨桥蛋白水平极显著高于其它三组(p<0.0001)，提示血清中骨桥蛋白的水平可以作为血清标志物，用于诊断和监测慢加急性肝衰竭患者。

血清中m30、m65和m30/m65在肝硬化失代偿组和慢加急性肝衰竭组比较见图2。

由图2可知，m30、m65在慢加急性肝衰竭患者显著高于肝硬化失代偿组(p<0.0001)，m30/m65在慢加急性肝衰竭患者显著低于肝硬化失代偿组(p<0.0001)。这与之前的文献报导相符。

在慢加急性肝衰竭患者中骨桥蛋白和meld、总胆红素、肌酐的相关性检测，结果如表1所示。

表1

由表1可知，慢加急性肝衰竭患者血清中骨桥蛋白水平与其meld、总胆红素和肌酐呈正相关(p<0.01)，可见慢加急性肝衰竭患者血清中骨桥蛋白水平和疾病严重程度有关。

骨桥蛋白、meld、m30、m65和m30/m65对于诊断慢加急性肝衰竭的受试者工作特征(roc)曲线的绘制如表2所示：

表2

由表2可知，从肝硬化失代偿患者中诊断出慢加急性肝衰竭患者，以血清中骨桥蛋白水平作为生物标志物的诊断效果(0.9454)明显高于m30(0.7167)、m65(0.8319)和m30/m65(0.8100)，且与临床上常用指标meld(0.9317)几乎持平。

综上所述，本发明提供了一种在失代偿肝硬化快速诊断并筛选慢加急性肝衰竭患者的方法，从而实现患者的及时且正确的治疗；本发明还可用于监测患者的病程进展，以便于调整治疗策略，防止治疗不及时不恰当引起患者死亡，极具临床价值及应用前景。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。