基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法与流程

本发明涉及一种基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法。

背景技术：

氧化还原蛋白质或酶在基底上的固定是不依赖于媒介体的电化学生物传感器、生物反应器以及其它生物装置的重要前提，并引起了研究者的广泛关注。在固体表面固定酶或蛋白质并有效实现蛋白质直接电化学的方法之一是将其固定在修饰于电极表面的薄膜中。在各种制备薄膜的方法中，层层组装(layer-by-layer,lbl)技术表现出显著的优势，它能够根据预先设计的方案在纳米或分子层次上控制薄膜的组成与厚度，并且组装程序非常简便。lbl组装的成膜驱动力逐渐由静电作用力扩展到各种各样的非静电相互作用如离子-偶极作用力、氢键作用和特异性相互作用等。在各种特异性相互作用中，硼酸基团和二醇单元之间的相互作用在构筑薄膜方面引起了许多研究者的兴趣。苯硼酸(phenylboronicacid,pba)及其衍生物能够与各种1,2-或1,3-顺二醇化合物(如多元醇、糖类化合物)生成硼酸-二醇间的共价键，并形成五元或六元环状的硼酯复合物。如聚乙烯醇或甘露糖可以与含有pba基团的聚电解质构筑lbl薄膜。一个单糖分子通常含有5个-oh基团，而一个pba基团可以与两个-oh基团结合，因此它们可以形成1:2的糖-pba复合物。葡聚糖(dextran,dex)是以葡萄糖为单体的聚多糖，其分子骨架上含有许多可以与pba基团结合的葡萄糖单元。虽然dex和pba之间的特异性亲和作用已有报道，但是由dex与含有pba基团的聚电解质构筑的蛋白质层层组装薄膜至今未见报道。

目前吸入型蛋白质lbl薄膜已经发展成为一种新型的蛋白质lbl薄膜：将固体基底表面组装的聚合物和/或纳米粒子lbl薄膜浸泡在蛋白质溶液中，使蛋白质自发吸入薄膜，形成吸入型蛋白质lbl薄膜。与通常的直接将蛋白质和其他组分构筑的蛋白质lbl薄膜相比，吸入型蛋白质lbl薄膜中的蛋白质是自发地扩散进入薄膜内部，并且独立于lbl薄膜的组装过程，因此该方法在保持蛋白质的原有结构和生物活性方面表现出独特的优点。在电极上构筑不同类型的吸入型蛋白质lbl薄膜的研究已有报道，并实现了氧化还原蛋白质在该类型薄膜电极上的直接电化学。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种合成了既含有苯硼酸pba基团又含有羧酸基团的聚电解质paa-pba的基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法。

本发明基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法，包括：

通过氨基苯硼酸与聚丙烯酸paa的羧基之间的缩合反应将苯硼酸pba基团接枝到聚丙烯酸paa骨架上，得到产物聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba；然后利用聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba与葡聚糖dex之间的硼酸-二醇特异性识别作用在热解石墨pg电极表面上组装{paa-pba/dex}nlbl薄膜，然后再从溶液中吸入肌红蛋白mb，形成{paa-pba/dex}n-mb薄膜。

进一步地，聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba的合成包括：

聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba聚电解质是由聚丙烯酸paa与3-氨基苯硼酸半硫酸盐apba在交联剂n-羟基丁二胺磺酸钠nhs和n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亚胺盐酸盐edc存在的条件下发生缩合反应，将pba接枝到paa骨架上而合成的，其合成路线如下式所示：

进一步地，聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba的合成具体包括：

将0.57g的聚丙烯酸paa水溶液，聚丙烯酸paa水溶液含有2.77mmol单体用20ml,50mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸hepes缓冲溶液稀释，将溶液ph调至8.5；将20ml,61mm的3-氨基苯硼酸半硫酸盐apba同样溶于ph8.5的20ml,50mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸hepes缓冲溶液中；然后将上述两种溶液混合；逐滴加入含有4ml,31mm的n-羟基丁二胺磺酸钠nhs的50mm,ph8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸hepes缓冲溶液，并搅拌10min；将含有4ml,310mm的n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亚胺盐酸盐edc的50mm,ph8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸hepes溶液加入上述反应混合溶液中，室温下搅拌12h；然后将上述溶液透析一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干燥后得到产物聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba，为白色粉末状固体。

进一步地，{paa-pba/dex}n-mb薄膜的组装包括：

热解石墨pg电极的制作：用热缩管将直径为4.5mm，长6mm左右的圆柱型热解石墨密封在直径与之相等的不锈钢圆柱棒一端，使热解石墨pg的一侧表面紧贴在不锈钢棒一端的表面，从而形成导电通路，而热解石墨pg的另一侧表面作为电极表面；将电极表面在320目的金相砂纸上打磨后，再在蒸馏水中超声30s，洗净吹干，即可作为工作电极；电极表面的几何面积为0.16cm²；

将处理好的pg电极首先浸入带有正电荷的1mgml^–1,ph5.0壳聚糖cs溶液中15min，使之在热解石墨pg表面吸附一层壳聚糖cs前驱膜；然后将pg/cs电极交替浸入带有负电荷的1mgml^–1,ph9.0的paa-pba和中性1mgml^–1,ph9.0的dex水溶液中各15min，溶液转换时用水清洗并吹干，在电极表面形成一个paa-pba/dex双层；重复上述过程直到在pg/cs表面上形成所需双层数的{paa-pba/dex}nlbl薄膜；将组装好的上述薄膜电极浸入1mgml^–1的mb溶液，中预定时间，以确保mb分子扩散进入到薄膜内部，然后取出洗涤并吹干，表示为{paa-pba/dex}n-mb；mb溶液为ph5.0，含0.2mnacl。

与现有技术相比，本发明基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法具有以下优点：

本发明合成了既含有苯硼酸(pba)基团又含有羧酸基团的聚电解质paa-pba(paa：聚丙烯酸)。采用层层组装(lbl)技术，利用paa-pba和葡聚糖(dex)之间的硼酸-二醇特异性识别作用，在热解石墨电极(pg)表面构筑了{paa-pba/dex}nlbl薄膜，再从溶液中吸入肌红蛋白(mb)，形成{paa-pba}n-mb薄膜；采用循环伏安方法研究了{paa-pba/dex}n薄膜中mb的直接电化学及其对氧气和过氧化氢的电催化还原。结果表明该薄膜为保持mb的生物活性提供了良好的微环境，为蛋白质的固定提供了一种新型的lbl薄膜，为设计基于酶的直接电化学的生物传感器提供了一个新的思路。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是在mb溶液中浸泡9h后的{paa-pba/dex}n-mb薄膜表现出不同的γ*值；

图2是用sem对组装在pg/cs表面的{paa-pba/dex}6层层组装薄膜的表面形貌图；

图3是用sem对组装在pg/cs表面的{paa-pba/dex}6/paa-pba层层组装薄膜的表面形貌图；

图4是用sem对组装在pg/cs表面的{paa-pba/dex}6-mb层层组装薄膜的表面形貌图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

如图1所示，本发明一种基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法的最佳实施例，包括：

通过氨基苯硼酸与聚丙烯酸paa的羧基之间的缩合反应将苯硼酸pba基团接枝到聚丙烯酸paa骨架上，得到产物聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba；然后利用聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba与葡聚糖dex之间的硼酸-二醇特异性识别作用在热解石墨pg电极表面上组装{paa-pba/dex}nlbl薄膜，然后再从溶液中吸入肌红蛋白mb，形成{paa-pba/dex}n-mb薄膜。

进一步地，聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba的合成包括：

聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba聚电解质是由聚丙烯酸paa与3-氨基苯硼酸半硫酸盐apba在交联剂n-羟基丁二胺磺酸钠nhs和n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亚胺盐酸盐edc存在的条件下发生缩合反应，将pba接枝到paa骨架上而合成的，其合成路线如下式所示：

paa-pba的合成，其过程为，将0.57g的paa水溶液(含有2.77mmol单体)用hepes缓冲溶液(20ml,50mm)稀释，将溶液ph调至8.5；将apba(20ml,61mm)同样溶于ph8.5的hepes缓冲溶液(20ml,50mm)中；然后将上述两种溶液混合。逐滴加入含有nhs(4ml,31mm)的hepes缓冲溶液(50mm,ph8.5)，并搅拌10min。将含有edc(4ml,310mm)的hepes溶液(50mm,ph8.5)加入上述反应混合溶液中，室温下搅拌12h。然后将上述溶液透析一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干燥后得到产物paa-pba，为白色粉末状固体。

{paa-pba/dex}n-mb薄膜的组装：

pg电极的制作：用热缩管将直径为4.5mm，长6mm左右的圆柱型basalplane热解石墨密封在直径与之相等的不锈钢圆柱棒一端。使pg的一侧表面紧贴在不锈钢棒一端的表面，从而形成导电通路，而pg的另一侧表面作为电极表面。将电极表面在320目的金相砂纸上打磨后，再在蒸馏水中超声30s，洗净吹干，即可作为实验中使用的工作电极。电极表面的几何面积为0.16cm²。

将处理好的pg电极首先浸入带有正电荷的cs溶液(1mgml^–1,ph5.0)中15min，使之在pg表面吸附一层cs前驱膜。然后将pg/cs电极交替浸入带有负电荷的paa-pba(1mgml^–1,ph9.0)和中性dex(1mgml^–1,ph9.0)水溶液中各15min，溶液转换时用水清洗并吹干，可在电极表面形成一个paa-pba/dex双层。重复上述过程直到在pg/cs表面上形成所需双层数(n)的{paa-pba/dex}nlbl薄膜。将组装好的上述薄膜电极浸入1mgml^–1的mb溶液(ph5.0，含0.2mnacl)中一定时间，以确保mb分子扩散进入到薄膜内部，然后取出洗涤并吹干，表示为{paa-pba/dex}n-mb。然后将固载了mb的薄膜转移到ph7.0的空白缓冲溶液中进行电化学研究。

采用循环伏安方法研究了{paa-pba/dex}n薄膜中mb的直接电化学及其对氧气和过氧化氢的电催化还原。

马骨骼或肌肉肌红蛋白(mb,mw≈17800)，3-氨基苯硼酸半硫酸盐(apba)，聚丙烯酸(paa,mw≈100000,35wt.％水溶液)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes,99.5％)，n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基丁二胺磺酸钠(nhs)，葡聚糖(dex,mw～200000)和壳聚糖(cs，酰胺化程度大于85％，mw≈200000)，醋酸钠(分析纯)，磷酸二氢钠(分析纯)均购自sigma-aldrich。k3fe(cn)6，k4fe(cn)6和过氧化氢(h2o2,30％)购自北京化工厂。缓冲溶液为0.1m醋酸钠溶液(ph4.0-6.0)，0.05m的磷酸二氢钠溶液(ph7.0-8.5)和0.05m的硼酸溶液(ph9.0)，用稀hcl或koh溶液调节到所需ph值，缓冲溶液中均含有0.1mnacl。所有溶液均用经过离子交换和蒸馏纯化的三次蒸馏水配制。实验用水均为经过离子交换和蒸馏纯化的三次水。

电化学测量采用chi660a型电化学工作站(美国chi仪器公司)，使用典型的三电极体系，参比电极：饱和甘汞电极(sce)，辅助电极：铂电极，工作电极：修饰有lbl薄膜的热解石墨(pyrolyticgraphite，简称pg，来自advancedceramics)电极。电解池中的缓冲溶液为不含蛋白质的空白缓冲溶液。在电化学测量前，向缓冲溶液中通入高纯氮10min以除去溶液中的氧气，并在整个实验过程中始终保持氮气氛围(o2催化实验除外)。电化学阻抗谱(eis)实验以等浓度的fe(cn)6³-和fe(cn)6⁴-溶液(5mm，含0.1mnacl)作为电活性探针，在其式量电位0.17v(vssce)上施加小振幅的正弦交流电压，振幅为±5mv，频率范围为0.1-10⁵hz。扫描电子显微镜(sem)实验采用s-4800冷场发射扫描电子显微镜(hitachi)，加速电压为3kv。组装在pg电极上的lbl薄膜作为测试样品。在sem实验之前，采用e-1045离子溅射仪(hitachi)在样品表面镀一层铂膜。所有的实验均在室温(20±2℃)下进行。

{paa-pba/dex}nlbl薄膜的层层组装：

打磨后的planepg电极暴露出一些edge面，因此既具有疏水性也具有一定亲水性。由于edge面的碳被氧化后连接有o^-，oh^-等基团，因此表面带一定负电荷。cs在ph5.0时因pka≈6.5[i]而带有正电荷，因此可以作为前驱膜吸附在pg电极表面。paa-pba的分子骨架中含有大量的自由的-cooh基团，paa在水溶液中的pka约为6.0，因此在ph9.0时paa-pba中自由的羧基被离子化而带负电荷，这样带负电荷的paa-pba可以被静电吸附到带有相反电荷的pg/cs膜表面。因此pg电极与cs之间、cs与paa-pba之间的组装驱动力主要是静电相互作用力。但是后续组装的dex是一种不带电荷中性聚多糖，因此dex在paa-pba表面的吸附以及后续{paa-pba/dex}n多层膜组装的主要通过硼酸-二醇特异性识别作用相结合。

本发明采用循环伏安(cv)法，以k3fe(cn)6为电活性探针监测{paa-pba/dex}n薄膜在pg电极表面的组装。在裸的pg或pg/cs薄膜电极上，k3fe(cn)6在ph7.0的溶液中于0.17v附近表现出一对良好的、近乎可逆的cv还原氧化峰。而当{paa-pba/dex}nlbl薄膜组装到pg/cs表面时，探针的cv峰电流显著下降，这是因为在电极表面形成的薄膜屏障阻碍了探针到达底层的电极表面并进行电子交换。随着薄膜双层膜数n的增加，k3fe(cn)6的电流逐渐降低，由此表明在pg电极表面成功构筑了{paa-pba/dex}n多层薄膜。

{paa-pba/dex}n薄膜对mb的吸入：

在合适的条件下，mb能够从其水溶液中自发地被吸入到{paa-pba/dex}n薄膜之中，形成{paa-pba/dex}n-mb薄膜。首先采用电化学阻抗谱(eis)法以fe(cn)6^3-/4-为电活性探针证实mb被吸入和固定于{paa-pba/dex}6薄膜中。对于裸的pg电极和pg/cs薄膜，fe(cn)6^3–/4–的eis响应在ph7.0溶液中都表现为一条warburg直线，这是受扩散控制的电化学过程的特征。当{paa-pba/dex}6薄膜在mb溶液中的浸泡9h后，在高频区可以观察到一个明显的半圆形响应(曲线d)，其eis响应的半圆直径远远大于吸入mb之前的{paa-pba/dex}6薄膜的半圆直径(曲线c)。半圆的直径通常等于探针的电荷转移电阻。对于薄膜体系，电荷转移电阻主要反映了探针在薄膜中扩散的难易程度，与薄膜的通透性直接相。由此说明吸入{paa-pba/dex}6薄膜中的mb作为物理屏障进一步阻碍和限制了探针到达电极表面，从而反过来证实了mb在薄膜中的吸入。

在这里，mb的等电点为6.8，其表面净电荷在ph5.0时为正。而{paa-pba/dex}6薄膜是由带负电荷的paa-pba和不带电荷的dex两种成膜材料组成，因此{paa-pba/dex}6薄膜带负电荷。在ph5.0条件下，带负电荷的薄膜将吸引带正电荷的mb。因此，mb和{paa-pba/dex}6薄膜中paa-pba组分之间的静电吸引力也是促使薄膜吸入mb的另一重要驱动力。

由于薄膜中的mb具有电活性，可以作为指示剂，因此其吸入过程也可以通过cv响应来监测。例如，将组装了{paa-pba}6薄膜的pg电极浸入mb溶液中一定时间，水洗吹干，然后转移到ph7.0的空白缓冲溶液中，在+0.1v至-0.8v的电位范围进行cv扫描，在-0.34v(vssce)处可以观察到一对可逆性良好的还原氧化峰，这是mb中血红素fe(iii)/fe(ii)电对的特征峰。平行实验中的6组{paa-pba}6-mb薄膜电极的平均式量电位为-0.34v，标准偏差为0.011v，表明薄膜的重现性非常好。而不含mb的{paa-pba}6薄膜在此电位范围内没有任何cv响应。mb的cv还原峰电流(ipc)随着{paa-pba}6多层膜在mb溶液中浸泡时间的增长而增加，在大约9h后达到稳态。因此，在以后的实验中，我们均采用9h作为在mb溶液中的浸泡时间。{paa-pba}6-mb薄膜的cv阴极峰和阳极峰的峰高和峰面积几乎相等，且在0.05–2.0vs^-1的范围内峰电流与扫速呈线性关系，表明该薄膜中的mb的伏安行为具有典型的非扩散控制的薄层电化学的特征。在此条件下，对{paa-pba}6-mb薄膜的cv阴极峰进行积分，可得到薄膜中全部电活性的mb发生还原反应时的电量q，根据法拉第定律q＝nafγ*，可以将q进一步换算为电活性mb在薄膜电极上的表面浓度(г*,molcm^-2)^[32]。其中n是电子转移数(1)，a是pg电极表面的几何面积(0.16cm²)，f为法拉第常数(96487cmol^-1)。如果采用γ*9h表示在mb溶液浸泡9h后薄膜中电活性mb的表面浓度，则6组平行实验的{paa-pba}6-mb薄膜的平均γ*9h约为1.25×10^-10molcm^-2。

双层数对吸入mb量的影响：对于双层数n不同的{paa-pba/dex}n-mb薄膜，mb在薄膜电极上的表面浓度γ*与浸泡时间的关系表现出相同的趋势，即γ*随着时间的增加而增大，在大约9h后趋于稳态。但是当双层数不同时，在mb溶液中浸泡9h后的{paa-pba/dex}n-mb薄膜表现出不同的γ*值(图1)，γ*值随着双层数n的增加而增加，当n＝6时，γ*值达到最大值，继而呈现下降趋势。因此在以后的实验中我们选择双层数为6的{paa-pba}6-mb薄膜作为主要研究对象。这是因为随着薄膜双层数n从1到6的不断增加，{paa-pba/dex}n薄膜变得越来越厚，这样可以吸纳更多的mb分子，因而倾向于获得更大的γ*值；但是同时薄膜的通透性会随着薄膜厚度的增加而降低，因此溶液中小分子量的对离子进出薄膜变得越来越困难，导致mb分子之间的电子自交换更加困难，故γ*值呈减小的趋势。这两种效果相反的因素共同作用，使得γ*值在n＝6时达到最大值。

{paa-pba}6-mb薄膜具有良好的稳定性。将{paa-pba}6-mb薄膜置于空白缓冲溶液中，在所研究的电位范围内进行cv扫描200圈后，cv峰的位置仍然保持不变，峰高只下降了约1.5％。将{paa-pba}6-mb薄膜置于空白缓冲溶液中浸泡一周后，其峰电流值仍能够保持其起始峰高的80％。

表面形态特征：

用sem对组装在pg/cs表面的{paa-pba/dex}6，{paa-pba/dex}6/paa-pba和{paa-pba/dex}6-mb层层组装薄膜的表面形貌进行了表征(图2、3、4)。从图中可以看出，在相同的放大倍率下，{paa-pba/dex}6薄膜和{paa-pba/dex}6/paa-pba薄膜的表面形貌比较平整，并能观察到一些孔洞或通道，没有表现出明显的差异，表明组装过程中相邻的paa-pba与dex层有一定程度的相互交错或者渗透。而{paa-pba/dex}6-mb薄膜显示出相对粗糙的表面，说明溶液中的mb分子不但被“吸入”到薄膜的内部，而且吸附在{paa-pba/dex}6薄膜的表面。在这里，需要说明的是被“吸入”到薄膜的内部的mb对{paa-pba/dex}6-mb直接电化学响应做出了主要贡献，这是因为溶液中的mb在薄膜表面的吸附过程一般不到30min即可达到稳态^[ii]，而本实验中mb在{paa-pba/dex}6薄膜中的固载达到稳态所需要的时间大约需要9h，表明蛋白质进入薄膜是一个相对缓慢的过程。

测试底液中ph和支持电解质的影响：

测试底液的ph对{paa-pba/dex}6-mb薄膜的cv响应也有很重要的影响。将已经吸入mb达稳态的{paa-pba/dex}6-mb薄膜电极置于含有0.1m的nacl而不同ph的测试底液中进行cv扫描，mb的cv峰位置表现出明显的移动。若定义cv氧化峰和还原峰的峰电位的平均值作为体系的式量电位(e°′)，e°′随着底液的ph的增加而负移。在ph4.0到9.0范围内，e°′与测试底液的ph成线性关系，斜率为-53.3mvph^-1。该值近似于具有相同质子与电子转移数的伴随着有质子转移的可逆电极反应的理论值-58mvph^-1(20℃)。由此说明该薄膜电极上mb的血红素辅基在发生单电子传递的同时，很可能伴随着一个质子的转移：mbfe(iii)+h⁺+e^-＝mbfe(ii)。

根据电子跳跃机理，{paa-pba/dex}6-mb薄膜中mb分子与电极之间发生电子交换时为了补偿电子转移过程中造成的薄膜内的电荷改变，即维持薄膜相的电中性，溶液相中的对离子必须能够进入或离开薄膜相以补偿由于电子转移造成的薄膜内部电荷的不均衡。例如，当薄膜内mbfe(iii)发生还原时，薄膜内会产生多余的负电荷，因此需要薄膜相中的阴离子转移到溶液相，或者溶液相中的阳离子转移到薄膜相，以补偿由于电子转移所产生的多余负电荷。因此我们选用相同浓度的不同支持电解质作为测试底液来对薄膜进行cv测试，考察了不同类型支持电解质对{paa-pba/dex}6-mb薄膜电化学行为的影响。实验结果表明：不同的支持电解质对{paa-pba/dex}6-mb薄膜的cv峰形的影响很小，它们峰高和峰电位基本一致。

{paa-pba/dex}6-mb薄膜的电催化性质：

用循环伏安法法研究了{paa-pba}6-mb薄膜电极对氧气和过氧化氢等底物的电化学催化还原行为。当用注射器向经过除氧的ph7.0缓冲溶液中注入一定量的空气后，与通入氧气之前相比，可以观察到{paa-pba}6-mb薄膜电极在大约-0.4v左右的cv还原峰电流随着空气通入量的增加而显著增加，并且伴随着mbfe(ii)氧化峰的消失，这是由于mbfe(ii)已经与溶液中的氧发生了化学反应。而对于不含mb的{paa-pba}6薄膜电极，氧气直接还原的峰电位大约在-0.9v左右。因此，{paa-pba}6-mb薄膜中的mb使氧的还原过电位降低了大约0.5v。结果证明了薄膜中的mb可以有效地电催化还原o2。

{paa-pba}6-mb薄膜电极也可以用来电催化还原h2o2。将h2o2注入ph7.0的缓冲溶液中，cv结果显示：{paa-pba}6-mb薄膜电极中mb的cv氧化峰降低而还原峰显著增大，并随着溶液中h2o2浓度的增大，还原峰电流值逐渐增高，线性范围2.0-85μm。然而对于不含mb的{paa-pba}6薄膜，在扫描电位0.1至-1.2v的电位范围内则没有观察到h2o2的直接电化学还原信号。

本发明首先合成了既含有pba基团又含有羧酸基团的聚电解质paa-pba，然后将paa-pba作为成膜材料，利用paa-pba和dex二者之间的硼酸-二醇特异性识别作用，采用层层组装(lbl)技术，在电极表面上成功构筑了{paa-pba}nlbl薄膜。生物大分子mb可以自发地从ph5.0的缓冲溶液中进入该多层薄膜中，形成稳定的{paa-pba/dex}n-mblbl薄膜。{paa-pba}n薄膜为保持mb的生物活性提供了适宜的微环境，并成功实现了mb在薄膜中的直接电化学及其对氧和过氧化氢的电催化还原。采用各种方法表征了{paa-pba}n多层膜的组装及{paa-pba}n-mb薄膜的性质，如循环伏安法(cv)、电化学阻抗法(eis)和扫描电子显微镜(sem)等。本发明利用硼酸-二醇特异性识别作用构筑的{paa-pba/dex}n-mb吸入型蛋白质层层组装薄膜是一种新类型的蛋白质lbl薄膜，可作为不依赖于媒介体的电化学生物传感器的基础，为设计基于酶的直接电化学的生物传感器提供了一个新的思路。另外，本发明对该模型体系中{paa-pba/dex}n多层膜的组装及mb吸入过程中的各种相互作用力的探讨也可以有助于发展新型的基于蛋白质直接电化学的生物传感器和生物反应器。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。