一种利用近红外光谱快速测定甘蓝型油菜种子中生育酚含量的方法与流程

本发明涉及作物品质育种领域，具体涉及到一种利用近红外光谱快速测定甘蓝型油菜种子中生育酚含量的方法。

背景技术：

维生素e，包括生育酚和生育三烯酚，是一种重要的脂溶性维生素，它具有很强的抗氧化性，在动植生命中有着不可替代的重要地位。天然维生素e主要合成于油料作物的种子和叶片。油菜属于双子叶植物，只含有生育酚，由于油菜种子富含生育酚且种植面积大，因此油菜生育酚育种日渐成为研究的热点之一，越来越受到育种工作者的关注。油菜籽粒生育酚含量的测定主要通过液相色谱法(hplc)进行测量，一般都比较复杂，它既要消耗种子，还要使用大量的化学试剂，无论是从时间、资金还是环境保护来说，都需要寻求更方便有效的方法。

近红外光谱分析是近些年来在分析测试行业的逐渐备受关注的一门新技术，凭借其快速高效无损的检测优势，在农作物领域得到广泛的应用，但利用近红外光谱测定油菜或其它作物种子生育酚含量的方法至今尚未见报道，虽然在饲料维生素e含量检测中有所应用，但在饲料中建立的模型或即使利用其它种子建立的分析模型对油菜种子维生素含量的测定也是完全不适合的，这主要是因为不同作物种子所含化学成分不同，含氢基团倍频与合频振动频率不同，则近红外图谱的峰位、峰数及峰强也不同，即不同物质的光谱是存在特异性的，那么用油菜建立的模型仅适用于油菜，因此必须建立油菜种子自己的生育酚测量的方法。鉴于此，通过发明人的探索、研究，利用近红外光谱分析，可以实现甘蓝型油菜种子中生育酚含量的快速测定。

技术实现要素：

针对上述情况，本发明的目的就是为了提供一种利用近红外光谱专门快速测定甘蓝型油菜种子中生育酚含量的方法。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种利用近红外光谱快速测定甘蓝型油菜种子中生育酚含量的方法，包括下述步骤：

(1)利用近红外光谱仪采集表1中所有样品的近红外光谱数据

样品光谱采集所用的仪器为fossnipsystem公司的fosstr-3700型近红外快速品质分析仪，扫描波长为1100-2500nm，分辨率为2nm；每份材料扫描两次，扫描后取反射值r，再转化成log(1/r)保存到光谱文件中，逐份扫描，得到所有油菜籽样品的光谱图；

(2)对步骤(1)获得的光谱图进行预处理

即将所有甘蓝型油菜种子光谱从fosstr-3700型近红外快速品质分析仪中导出，转入分析软件winisi中；对样品的光谱文件按编号进行合并后平均，即将每个样品的2次重复扫描光谱进行合并，得到一个新的平均后的光谱文件，以降低误差。

(3)利用winisi软件将表1中的β+γ-生育酚以及总生育酚含量一一对应的输入光谱文件中，建立校正模型；其中，建立β+γ-生育酚校正模型时采用的是表1中的295个样品，即除了表1中序号为108、143、171、179、206、229这7个样品外的所有样品；建立总生育酚校正模型采用的是表1中的286个样品，即除了表1中序号为9、15、26、29、62、74、76、99、116、121、135、162、224、230、255、291这16个样品外的所有样品；β+γ-生育酚以及总生育酚含量两种校正模型所采用的数学方法均为2,3,3,1；所用的回归方式为改进的偏最小二乘法(modifiedpls)；光谱散射处理方式采用标准正态变量转换+趋势变换法(snv+det)。

(4).采集待测样品的光谱，处理之后输入到校正模型中，得到待测样品的生育酚含量预测值。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的是一种利用近红外光谱快速测定甘蓝型油菜种子中生育酚含量的方法，该方法快速、准确、无损，操作简单，操作过程只需经过简单培训的工人即可完成，每个样品的测试过程不到2分钟，经验证，检测结果准确，高效。而直接利用标准方法(hplc)测量甘蓝型油菜种子中生育酚含量需要实验人员操作，每个样品所需时间达到4小时，并且不能对测量完成的样品进行回收。

附图说明

图1为建立近红外光谱技术快速测定甘蓝型油菜种子中生育酚含量模型的流程图。

图2为校正集甘蓝型油菜种子所有样品的近红外扫描光谱图。

图3为利用高效液相色谱法测得的甘蓝型油菜种子中生育酚含量的色谱图；

其中δ-t,is,γ+β-t,α-t分别表示δ生育酚、内标、γ和β生育酚之和、α生育酚。

图4为验证集利用校正模型计算得到的生育酚含量预测值和标准方法测定的化学值之间的关系散点图；

其中a图为γ+β-生育酚，b图为总生育酚。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种利用近红外光谱快速测定甘蓝型油菜种子中生育酚含量的方法，包括下述步骤：

1.收集甘蓝型油菜样品。

为保证分析模型的准确性，必须选取一批遗传多样性丰富的油菜种子。鉴于此，首先利用从全国各地收集的有代表性的一批油菜自交系，通过分子标记分析、生育酚含量测定，从中筛选出373份在生育酚含量、群体结构、遗传多样性均存在较大差异的甘蓝型油菜种子，然后将这373份材料分成两组，第一组作为校正集，用于建立近红外校正模型；第二组作为验证集，用于验证近红外校正模型的准确性，其中校正集302份，验证集71份，所述的373份样品参考lius,fanc,lij,etal.agenome-wideassociationstudyrevealsnoveleliteallelicvariationsinseedoilcontentofbrassicanapus.[j].theoreticalandappliedgenetics,2016,129(6):1203-1215.，具体如下表所示：

表1校正集甘蓝型油菜样品材料编号及hpcl测得的生育酚含量

表2验证集甘蓝型油菜样品材料编号及hplc测得的生育酚含量

2.利用近红外光谱仪采集校正集所有样品的近红外光谱数据。

样品光谱采集所用的仪器为fossnipsystem公司的fosstr-3700型近红外快速品质分析仪，扫描波长为1100-2500nm，分辨率为2nm。每份材料扫描两次，扫描后取反射值r，再转化成log(1/r)保存到光谱文件中，逐份扫描，得到所有油菜籽样品的光谱图。

3.对校正集的光谱进行预处理。

将校正集所有甘蓝型油菜种子光谱从近红外仪器中导出，转入分析软件winisi(本实施例使用的是winisiiii)中。对样品的光谱文件按编号进行合并后平均，将每个样品的2次重复扫描光谱进行合并，得到一个新的平均后的光谱文件，以降低误差。

4.利用标准的方法测定校正集所有样品的化学值，即样品的生育酚含量。

本发明所使用的测定甘蓝型油菜种子中生育酚含量的标准方法是高效液相色谱法(hplc)，所用的仪器是安捷伦(agilent)1260高效液相色谱仪，该仪器配有自动进样器、真空脱气机、色谱工作站以及荧光检测器。

样品处理方法为：

(1)取干燥的甘蓝型油菜种子约50mg，精确称量；

(2)加1.5ml含有0.01％bht提取液(体积比为9:1的甲醇、二氯甲烷混合液)；

(2)利用购自美国的sk450型混合机将样品研磨3min，之后在常温下震荡提取4h；

(3)12000r/min条件下离心20min，取400ul上清于进样瓶中；

(4)用agilent1260高效液相色谱仪对玻璃品种的样品进行检测；

(5)采用内标定量法，每个样品中加入60μl的50ng/μl的5,7-二甲基生育酚的正己烷溶液；

(6)图像显示及处理软件为workstationtoolar；分别计算出β+γ-生育酚以及总生育酚含量(由于α-生育酚、δ-生育酚含量较低，故不用于建立模型)。对校正集各样品的的检测结果如表1所示，结果显示，γ+β-生育酚含量在133.78～396.69ug/g之间，总生育酚在216.12～522.21ug/g之间，最高值与最低值均相差两倍以上，变化幅度均较大，由于历史上油菜籽粒维生素e含量从来没有作为一个重要性状进行过人工选择，这样的含量变异基本上代表了绝大多数不同油菜籽粒维生素e含量的变化幅度，因此利用这些样品建立的模型同样适合用于绝大多数油菜种子维生素e含量的测定。

色谱分析条件为：(1)色谱柱：c18柱(4.6mmid×12.5mm，4-pack)，柱温30℃；(2)荧光检测器：激发波长为292nm，发射波长330nm，检测时间为20min；(3)进样量为20ul；(4)流动相为水:甲醇＝5:95(体积比)，变换至水:甲醇＝0:100(体积比)，流速为1.5ml/min。

5.将校正集的光谱数据与化学值相关联，建立定标方程。

利用winisi软件将hplc得到的两种化学值(β+γ-生育酚以及总生育酚含量)一一对应的输入光谱文件中；选择计算和利用得分程序，以pca计算方式(利用文件中的扫描数据计算得分，以此统计文件中各样品间的差异)和光谱文件中所有样品得分的平均值作为中心，以此来计算每个样品的马氏距离，将马氏距离设置为3.0，即每个样品离中心样品点的距离超过该值，就被视为超常样品，就被剔除，最终有295个样品(表1中除了序号为108、143、171、179、206、229这7个样品)用于建立β+γ-生育酚校正模型，286个样品(表1中除了序号为9、15、26、29、62、74、76、99、116、121、135、162、224、230、255、291这16个样品)用于建立总生育酚校正模型。

6.采用不同的数学处理技术和散射校正方法完成定标方程内部验证，选择最佳定标方程，确定校正模型；本发明中β+γ-生育酚以及总生育酚含量两种校正模型所采用的数学方法均为2,3,3,1(即做2阶导数处理、导数处理光谱间隔点为3、一次平滑光谱间隔点为3、二次平滑为1)、(2,3,3,1)；所用的回归方式为改进的偏最小二乘法(modifiedpls)；光谱散射处理方式采用标准正态变量转换+趋势变换法(snv+det)；选择最佳定标方程的主要参数有定标标准误差(sec)、交叉验证误差(secv)、定标决定系数(rsq)、交叉验证系数(1-vr)。通过这些参数判定定标方程的优劣。

7.采集验证集样品的光谱，处理之后输入到校正模型中，得到验证集样品的生育酚含量预测值。使用与校正集相同的方法得到处理过的验证集材料的光谱，利用winisi软件，通过建立的校正模型计算出验证集所有材料的预测值，校正集和验证集材料种子中生育酚含量如下表所示：

8.利用标准方法(hplc)测定校正集样品的生育酚含量，即化学值，并与预测值进行对比分析，实现对校正模型的外部验证。采用与校正集相同的方法测量出验证集所有样品的化学值，将验证集的化学值与通过模型得到的预测值进行对比分析，以验证校正模型是否可用，结果如下表所示：

说明：n,样本数；mean,平均值；sd,参考值的标准偏差；sec,校准标准误差；rsq,决定系数；1-vr,1-不可解释方差与总方差的比值；dt,导数处理；scm,散射校正方法；terms,用于校准的主成分数；group,校准集被划分成若干组；secv,交叉验证的标准误差；r²cv,交叉验证确定系数；rpd,比性能差(sd/secv)；sep,外部验证中预测的标准误差；r²ev,外部验证确定系数；snv+det,标准正态变量转换+趋势变换法；wmsc,加权多散射校正。

虽然本模型的rsq值相对有点低，但考虑到种子中生育酚含量低于种子干重的0.6％，这说明模型的质量较高，从上表中可看出交叉验证的rpd值在1.0～2.0之间，运用本模型是可以比较准确预测甘蓝型油菜种子中生育酚含量。此外，利用高效液相色谱法进行测量时从样品制备到完成分析所用时间接近5个小时，而利用本发明所述的方进行分析时，每份样品所用时间不超过3分钟，大大缩短了检测时间。这一模型的建立为油菜高生育酚育种提供了快捷有效的方法，从而将极大地加快新品种的选育进程。