一种利用拉曼光谱技术鉴定地沟油的方法与流程

本发明属于食品快速检测技术领域，具体涉及一种利用拉曼光谱技术准确、快速鉴定地沟油的方法。

背景技术：

地沟油：一般指各类废弃的劣质食用油，主要是餐厨废油脂，经过过滤、蒸馏、脱色而提炼后产出的油。残留数量不等的有毒有害成分，长期或大量食用对人体健康极为有害。据不完全统计，我国每年多达300万吨的地沟油流向国人餐桌，因此地沟油的鉴别方法及指标也被国人广泛关注。地沟油在国内长期存在的原因，一方面是高额的利润回报，地沟油比正常的食用油一顿要多收益近2000元。另一方面是缺乏准确、有效的地沟油鉴定技术，目前，针对地沟油中存在的有毒有害物质进行鉴别已开展了大量的探索性工作，建立了以胆固醇及脂肪酸组成分析、电导率、外来污染物的检测(脂肪酸、胆固醇、苯并芘、多环芳烃、塑化剂、黄曲霉毒素)等鉴别地沟油的方法。如专利201110131492.4报道的使用gc-ms对有机酸进行检测，专利201110333314.x利用gc-ms对高级脂肪酸进行检测，专利201510365203.5对胆固醇进行检测。以上报道大都使用大型的色谱仪器进行检测，不适合快速筛查，而且上述指标在正常食用油里均存在，上述指标只能决定油品品质好坏、是否达到正常的食用标准，因此即使是某一项或几项超标，有可能是在原料炼制或存储过程中引入的外源性污染，并不能作为地沟油的定性标准。因此，地沟油的定性检测手段一直是分析化学领域亟待解决的问题。

辣椒碱是引起辣味的主要化学成分，主要存在于辣椒中，而辣椒是饮食中常用的调料品，地沟油中必然含有辣椒碱。2012年，大连化物所陈吉平和重庆市公安局物证鉴定中心张忠课题组分别用固相萃取-液相色谱-串联质谱技术，建立了食用油(正常植物油或地沟油，根据文献报道(journalofchromatographybanalyticaltechnologiesinthebiomedical&lifesciences,2016,1021:137.)，只要检测的食用油里面含有辣椒碱，即可定性为地沟油)中3种微量辣椒碱(天然辣椒素、二氢辣椒素及丁香酚)的检测方法(液相色谱-同位素稀释质谱法检测食用油中辣椒碱类化合物[j].化学试剂,2016,38(6)：491-495；固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱快速检测食用油和地沟油中辣椒素和二氢辣椒素[j].分析科学学报,2014,30(6)：777-782；)。用该法对国家食品安全风险评估中心提供的67个盲样进行了分析，结果表明辣椒碱是一个良好的地沟油特征指示物。凭借这3种辣椒碱指标，阳性样品正确识别率达到75％，阴性样品正确识别率达到100％。目前本方法已经成为国家卫生部最新公布的4种地沟油仪器检测方法之一(张忠，任飞，张盼。液-液萃取-液相色谱-串联质谱法测定“地沟油”中辣椒碱类化合物及丁香酚[j].色谱,2012,30(11)：1108-1112)。

但液相色谱-串联质谱技术毕竟为大型仪器，价格昂贵，不适合现场快速检测，而且单靠在实验室里用认可的标准方法进行检测是难于及时、全面的来监控食品和环境的安全现状，因此，需要有一种快速的检测手段来准确的定性油品中的辣椒碱。表面增强拉曼散射(surfaceenhancedramanscattering,sers)技术是纳米材料与拉曼光谱技术相结合的有效产物，是现代检测中一项很重要的光谱技术，其检出能力可达到单分子水平，尤其在非法添加物的现场快速、痕量物质的定性检测方面越来越受到人们的关注。以其极高的灵敏度等优势广泛应用于化学、生物分析以及临床医学等诸多领域，如能实现sers技术用于辣椒碱的指纹识别，将实现地沟油的现场快速精准鉴定。

传统检测项目包括黄曲霉素、重金属、多氯联苯、多环芳烃、脂肪酸分布等，因植物油在炼制或存储的过程中也会引入上述物质，故上述物质的检测或超标不足以说明其为地沟油，只能说明植物油不合格。因此，针对这些目标物的检测对地沟油定性不准确；另外，检测方法多使用大型仪器，前处理复杂，检测成本高，测试周期长：如利用hplc-ms对一些无机盐、脂肪酸、辣椒碱等进行检测。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用拉曼光谱技术准确、快速鉴定地沟油的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案：其步骤为：

量取2～5ml需要检测的食用油，加入两倍体积的萃取试剂a，涡旋5～10min后磁辅助分离，从而从食用油中萃取出天然辣椒碱(cas号：404-86-4；分子式：c18h27no3；分子量：305.41)；再用2～5ml甲醇解析所萃取出的天然辣椒碱，得到甲醇萃取液；然后将该甲醇萃取液加入到等体积的衍生化溶液b中，室温涡旋反应1～3min；最后加入与上述全部反应溶液等体积的sers增强试剂c，室温涡旋反应1～3min后进行sers检测；如果sers谱图中出现天然辣椒碱的特征峰，则表明所检测的食用油为地沟油。

地沟油中辣椒碱的萃取：因地沟油中辣椒碱无法直接进行显色，因此，显色前需将辣椒碱与地沟油进行分离。为了选择一个简单快速的前处理方法，并与后续的衍生化反应相匹配，本发明采用磁固相萃取的方式进行，磁固相萃取采用氨基功能化四氧化三铁磁性微球，其制备过程如下：

(1)首先采用溶剂热法制备四氧化三铁磁性微球：2.7g六水三氯化铁和7.2g乙酸钠溶解到80ml乙二醇中，水浴60℃、磁力搅拌30min，当溶液转化成黑褐色时，将溶液全部转移到100ml的聚四氟高压反应釜中于马弗炉中200℃反应8h，获得的黑色反应溶液用乙醇、水交替清洗3～5次，60℃干燥12h，得到四氧化三铁磁性微球；

(2)用氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)对四氧化三铁磁性微球表面进行氨基化改性，过程如下：将0.1g四氧化三铁磁性微球溶解在无水乙醇和水的混合溶液中(体积比为80：20)，再加入1.0ml浓氨水(28wt％)，接着分别加入67μl正硅酸乙酯和67μl氨丙基三乙氧基硅烷，水浴35℃、机械搅拌3h，得到氨基功能化四氧化三铁磁性微球(fe3o4@nh2)，清洗干燥后分散于甲苯中配置成浓度为10mg/ml的溶液，即为萃取试剂a；

(3)配制衍生化溶液b：将衍生化试剂溶于0.2m的盐酸水溶液，配制成浓度为1～50mm的衍生化试剂溶液；将亚硝酸钠溶于水，配制成质量浓度为0.01～1.0％的亚硝酸钠水溶液；将碳酸钠溶于水，配制成质量浓度为0.01～5％的碳酸钠水溶液；衍生化试剂为苯胺类物质，如2-5-二氨基苯磺酸、2-5-二氨基二磺酸基联苯、4-氨基萘磺酸-水合物、6-氨基萘磺酸、二苯胺磺酸钠、对氨基苯磺酸中的一种，亚硝酸钠、碳酸钠作为辅助衍生化试剂；将上述三种溶液等体积混合，得到衍生化溶液b；

(4)sers增强试剂c的制备：sers增强试剂采用金溶胶或银溶胶，二者均采用质量分数为1％柠檬酸钠水溶液还原的方式，具体制备过程参考文献：j.phys.chem.1982,86：17(17),3391-3395，制备后的银、金溶胶水溶液可直接作为增强试剂。

sers基底对油品中辣椒碱的检测方法学的研究：虽然sers技术在定量检测方面存在局限性(重复性差)，但以辣椒碱作为外源性标记物对地沟油进行鉴定只需对辣椒碱进行定性检出即可，无需定量。因此，可以利用上述提取方法和衍生化技术，分别对地沟油中辣椒碱进行浓度检测并确定辣椒碱在地沟油中的最低检出浓度。

有益效果：本发明提供的地沟油检测方法，因正常食用油中不含有辣椒碱类物质，利用拉曼光谱仪通过增强试剂对油品中的辣椒碱进行检出，可对地沟油进行鉴定，该检测方法操作简便，灵敏度高，可有效监控地沟油。

本发明主要解决了现有地沟油鉴别方法中存在的两个问题，一是现有方法检测目标物作为地沟油的定性不准确，假阴性、假阳性概率较大。二是现有准确定性地沟油的方法所使用的仪器是hplc-ms，仪器昂贵、分析周期较长，不适合快速筛查。本发明地沟油的鉴别方法主要是针对辣椒碱可以作为准确鉴定地沟油的特征分子：只要检出油品中含有辣椒碱，即可定性为地沟油。基于表面增强共振拉曼散射(serrs)原理，利用小型便携式拉曼光谱仪、分子的衍生化，通过使用增强试剂，对地沟油的特征分子辣椒碱进行检测。该方法可实现辣椒碱的超灵敏检测，检测限可达到1.0×10^-9m，该方法为地沟油的鉴定提供了一种简单、快速、超灵敏的分析方法，具有目标物明确，特征性强，定性准确，操作简单，适用于快速检测等特点。

附图说明

图1为天然辣椒碱衍生化产物的sers谱图；

图2为四种酚类衍生物的sers谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1：

sers增强试剂的制备：将27mgagno3溶解到150ml超纯水中，煮沸后快速加入3.0ml、质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液，加热至回流，并保持10min，之后降温至到80℃反应40min，自然冷却至室温，得到作为sers增强试剂的银溶胶；

地沟油中的辣椒碱的检测采用标准物质加标的形式，即在合格的食用油中加入天然辣椒碱的方法来模拟检测的食用油(即地沟油)，天然辣椒碱购于阿拉丁试剂(cas号：404-86-4；分子式：c18h27no3；分子量：305.41)，天然辣椒碱的结构式如下式所示。加标的具体操作步骤为：利用分析天平取0.0305g天然辣椒碱溶于1ml甲醇中，随后加入到99ml大豆油中配置成10^-3m的辣椒碱母液。之后对上述母液用大豆油进行逐级稀释，分别稀释成10^-5m、10^-6m、10^-7m、10^-8m和10^-9m五个浓度的辣椒碱待测溶液，准确量取上述不同浓度加标油样2ml，分别加入两倍体积的萃取试剂a，涡旋5min后磁辅助分离出萃取材料，用2ml甲醇解析所萃取的天然辣椒碱，得到甲醇萃取液用于衍生化反应。

辣椒碱的衍生化和sers检测：以2,5-二氨基二磺酸基联苯为偶氮类衍生化试剂、亚硝酸钠水溶液和碳酸钠水溶液为辅助的衍生化试剂对天然辣椒碱进行衍生化反应。2,5-二氨基二磺酸基联苯盐酸水溶液的浓度为20mm(盐酸水溶液的浓度为0.2m)、亚硝酸钠和碳酸钠的质量分数均是1％，将甲醇萃取液600μl、2,5-二氨基二磺酸基联苯水溶液200μl、亚硝酸钠水溶液200μl、碳酸钠水溶液200μl分别加入2ml的离心管中，室温手动涡旋反应1min后用于sers检测。

sers检测过程如下：衍生化后的溶液500μl与同体积的增强试剂c混合后涡旋1min，直接用于拉曼光谱进行检测，检测条件：美国必达泰克，型号：btr-111mini；激光器波长为532nm，功率为3mw，积分时间为5s，积分次数为1次。天然辣椒碱进行衍生化反应的原理如下式所示。

油品中辣椒碱的检测方法学研究：

灵敏性：上述10^-9～10^-5m五个浓度的天然辣椒碱经过萃取、衍生化反应、拉曼检测得到的谱图见图1，以1361cm^-1处的强度为纵坐标，浓度的对数为横坐标，利用最小二乘法拟合标准曲线，拟合公式为：(y为1361cm^-1处的强度，x为浓度的对数)。从图1可以看出，辣椒碱衍生物的特征峰分别为：1191、1361、1429、1574和1606cm^-1，分别归属于辣椒碱衍生物的υ(c-c)(芳环)、δ(c-h)、ν(n＝n)、ν(c＝c)(苯环)和υ(c–n)的拉曼振动峰。从图1可以看出，辣椒碱最低检测浓度可以检测到10^-9m。

最低检出浓度阳性检出率：为了进一步验证该方法的适用性，我们对市场上采购的三种(金龙鱼大豆油两个(厂家：益海嘉里投资有限公司)、金龙鱼葵花籽油两个(厂家：益海嘉里投资有限公司)、多力调和油两个(厂家：佳格投资有限公司))、六个植物油同样采用加标的方法进行检测，六个10ml植物油样品中分别加入100μl的10^-6m天然辣椒碱(cas号：404-86-4；分子式：c18h27no3；分子量：305.41)油样配置成含有10^-8m辣椒碱的植物油，按照上文描述的萃取条件和衍生化方法进行样品前处理和衍生化反应，之后利用便携式拉曼光谱仪对样品进行检测，六个样品中全部检测出辣椒碱的sers信号，按上述标准曲线公式计算得出检出浓度和加标回收率(测量值/加标值×100％)如表1所示。

表1实际样品检测结果

干扰性试验：该衍生化方法对大部分酚类物质均能发生衍生化反应，而植物油或地沟油在炼制、存储、使用过程中会引入其他的酚类等污染物质，因此对植物油中可能存在的不同来源的酚类干扰物质进行干扰性实验。根据文献调研(jagrfoodchem2014,62(46),11130-11137；jagrfoodchem2013,61(44),10467-10475；jfoodsci2014,79(6),t1225-t1230)，植物油中主要存在三种酚类化合物可能会对辣椒碱的测定产生干扰：叔丁基对苯二酚、dl-α-生育酚和双酚a，三种干扰性物质的检测方法也采用加标的形式：加标方式同天然辣椒碱的加标方式一样，加标浓度为10^-5m。测试过程同天然辣椒碱一样，测试结果见图2，结果显示，三种物质并没有对天然辣椒碱的检测带来干扰，该方法对天然辣椒碱具有很好的选择性。

以上所述仅是本发明的优化实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，在此基础上使用拉曼光谱仪对地沟油的鉴定还可以做出若干技术改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。