一种基于稀土上转换发光强度比的荧光染料浓度的探测方法与流程

本发明涉及一种荧光染料浓度的测定方法，具体地说是一种基于辐射能量传递过程的稀土离子上转换发光强度比的技术，可用于进行与稀土离子具有能量传递的荧光染料的探测。

背景技术：

近年来由于稀土离子发光具有尖锐的发射、较大的stokes位移和较长的荧光寿命，使得稀土掺杂发光材料在照明、可视化应用、光通讯和生物医学等领域引起了人们极大的兴趣。稀土掺杂上转换发光材料由于通过多光子吸收过程能够将低能量光子转变为高能量光子，使得其在生物医学、光催化、太阳能电池和光学传感等领域得到广泛应用。其中，稀土上转换发光还具有生物组织穿透深度大、光损伤小、响应快速、空间分辨率高以及光漂白弱和背景噪声小等特性，在生物探测领域受到越来越多的关注(文献1：f.wang,x.g.liu,chemicalsocietyreviews,2009,38,976)。

基于稀土上转换发光的荧光染料传感器通过稀土离子到荧光染料分子的能量传递进行荧光染料的探测，这种能量传递要求稀土离子的发射光谱和荧光染料分子的吸收光谱之间有重叠。稀土离子到荧光分子的能量传递主要有荧光共振能量传递(fluorescenceresonanceenergytransfer-fret)和辐射能量传递(radiativeenergytransfer-ret)两种途径。fret是一种从稀土离子到荧光染料分子的无辐射能量传递过程，由于fret效率与两者间距离的六次方成反比，一般稀土离子与荧光染料分子的距离必须小于几个纳米(文献2：h.edelhoch,l.brand,m.wilchek,biochemistry,1967,6,547)。为了实现这种纳米级的距离要求，人们通常采用非常复杂的方法将稀土掺杂上转换发光材料和荧光染料分子进行连接，导致基于fret的生物传感器制备工艺十分复杂，加工性差(文献3：j.l.liu,y.liu,q.liu,c.y.li,l.n.sun,f.y.li,journaloftheamericanchemicalsociety,2011,133,15276)。由于进行生物探测的环境常常为水溶液环境，而稀土上转换发光对水环境非常敏感容易引起荧光猝灭，因此基于fret的生物传感器发光效率很低，稳定性较差(文献4：s.xu,w.xu,y.f.wang,s.zhang,y.s.zhu,l.tao,etal.,nanoscale,2014,6,5859)。此外，由于基于fret的生物传感器需要将稀土掺杂上转换发光材料和荧光染料分子进行连接，使得这种传感器再生性差，不可重复使用。

而ret是一种稀土离子的发光被荧光染料分子再吸收的过程，稀土离子发光可以远距离传播到荧光染料分子并被其再吸收，消除了fret要求的稀土掺杂上转换发光材料和荧光染料分子之间距离必须为纳米级的限制，因此不须进行稀土掺杂上转换发光材料与荧光染料分子的复杂连接，使得稀土掺杂生物传感器的制备工艺大大简化。此外，由于ret可以使得稀土发光远距离传播到荧光染料分子，因此稀土掺杂上转换发光材料可以不与荧光染料分子直接接触，从而避免了水环境造成的稀土离子上转换发光的猝灭效应，能够有效提高稀土上转换发光强度。由于基于ret的稀土掺杂生物传感器不需要进行稀土掺杂上转换发光材料与荧光染料分子的连接，使得稀土掺杂上转换发光材料可重复使用，大大降低了传感器的损耗。

目前，基于稀土上转换发光的生物传感器大部分都是通过测量荧光染料分子的发光对其浓度进行探测(文献4：s.xu,w.xu,y.f.wang,s.zhang,y.s.zhu,l.tao,etal.,nanoscale,2014,6,5859)，由于荧光染料分子的发光来自稀土离子到荧光染料分子的能量传递，而不论是fret还是ret其效率都不高，因此荧光染料分子的发光普遍较弱，造成测量误差较大和检测灵敏度较低。由于荧光染料分子发光来自于稀土离子的能量传递，因此也可以通过稀土离子的发光建立起与荧光染料分子之间的联系，从而实现荧光染料浓度的探测(文献5：y.h.wang,l.bao,z.h.liu,d.w.pang,analyticalchemistry,2011,83,8130)。然而稀土离子的上转换发光常常受到基质材料、发光能级、材料尺度、激发条件和外部环境和仪器条件变化等因素的影响，导致稀土离子的上转换发光强度受到上述因素的影响而不能进行精确测量，使得基于稀土上转换发光强度的生物传感器误差较大。而荧光强度比技术(fluorescenceintensityratio-fir)则能够很好地消除上述因素的干扰，其是一种通过采集与待测量有关的两个不同波长的发光强度，以两者的比值作为表征参数的方法，因此基于fir技术的光学传感器具有较高的灵敏度和分辨率。目前，基于fir技术的稀土掺杂光学温度传感器已经得到成功的应用并有着较高的温度灵敏度(文献6：x.f.wang,q.liu,y.y.bu,c.s.liu,t.liu,x.h.yan,rscadvances,2015,5,86219)。

本发明通过选定发射光谱与待测荧光染料分子吸收光谱有重叠的稀土离子，设计一种基于ret过程的荧光染料传感器，通过测量与荧光染料浓度相关的两个不同波长的稀土离子上转换发光，以其强度比作为表征参数实现荧光染料浓度的探测，达到操作简单、探测灵敏度高、可重复使用的目的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简单、探测灵敏度高、可重复使用的基于稀土离子上转换发光强度比的荧光染料浓度探测方法。

本发明的技术方案如下：

针对所需要探测的荧光染料分子种类的不同，选择合适的稀土离子，所选择的稀土离子与荧光染料分子之间存在有效的能量传递，稀土离子与荧光染料分子之间的能量传递为辐射能量传递过程。选择的依据是稀土离子的上转换发光光谱与荧光染料的吸收光谱有较大重叠，在光谱的重叠部分稀土离子具有两个以上不同波长的发光峰(包括stark发光峰)，且荧光染料分子对所选取的不同波长的上转换发光具有不同的吸收特性，且吸收系数差异越大，荧光染料浓度的探测灵敏度越高。以选取的两个不同波长的稀土离子上转换发光的强度比值作为表征参数，由于稀土离子能级丰富，上转换发光峰较多，可选择性也多。

由于本发明基于从稀土离子上转换发光到荧光染料分子的ret过程，因此荧光染料分子对稀土上转换发光的吸收符合beer–lambert定律：

式(1)中c为荧光染料浓度，iλ(0)和iλ(c)分别为荧光染料浓度为0和c时的波长为λ的上转换发光的强度，kλ为荧光染料对波长λ的光的吸收系数，l为波长λ的光在荧光染料中的穿透距离。考察波长为λ1和λ2的两个上转换发光，两者穿过浓度为c的荧光染料后的强度比值r为：

式(2)中为荧光染料对波长分别为λ1和λ2的两个上转换发光的吸收系数之差。由公式(2)可见，在测试条件一定时，δk和l为常数，因此lnr与浓度c呈线性关系。这种基于荧光强度比技术的荧光染料传感器的相对灵敏度可以表示为：

由公式(3)可见，基于荧光强度比技术的荧光染料传感器的相对灵敏度s取决于荧光染料对波长分别为λ1和λ2的两个上转换发光的吸收系数之差δk，吸收系数相差越大，浓度探测灵敏度越高。

本发明第二个目的请求保护基于ret过程的荧光强度比技术在荧光染料探测上的应用。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.本发明基于稀土离子的上转换发光，所采用的激发光为红外波段，在生物体液中的穿透深度大、光损伤小。

2.本发明基于稀土离子的上转换发光强度的比值，与绝对发光强度无关，因此探测精度高，实现精确测量。

3.本发明可针对所需探测的特定荧光染料，选择合适的稀土离子进行探测，有效降低测量误差，提高检测灵敏度。

4.本发明可在同一种稀土离子的上转换发光中，选吸收系数差异较大的两个波长的上转换发光进行表征，能有效提高探测灵敏度。

附图说明

图1为本发明实施例1中的稀土er³⁺离子掺杂材料的上转换发光光谱(实线)与罗丹明b(rhb)的相对吸收光谱(点线)和发射光谱(虚线)；

图2为本发明实施例2中的稀土tm³⁺离子掺杂材料的上转换发光光谱(实线)与荧光素fitc的相对吸收光谱(点线)和发射光谱(虚线)；

图3为本发明测量荧光染料浓度的系统示意图；

图4为本发明实施例1中的能量传递机理图；

图5为本发明实施例1中的不同rhb浓度条件下er³⁺的上转换发光光谱；

图6为本发明实施例1中的er³⁺的绿色上转换发光强度和rhb发光强度随rhb浓度的变化曲线；

图7为本发明实施例1中的er³⁺的两个绿色上转换发光强度比与rhb浓度之间的对数关系曲线(图a)和er³⁺的两个绿色上转换发光强度比与rhb浓度之间的关系曲线(图b)；

图8为本发明实施例1中的er³⁺绿色上转换发光光谱在中心波长521、525、531、544和553nm处进行的光谱分峰拟合；

图9为本发明实施例1中对不同rhb浓度下er³⁺绿色上转换发光光谱的光谱分峰拟合；

图10为本发明实施例1中er³⁺的不同的两个stark发光峰强度比与rhb浓度之间的对数关系曲线。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。

实施例1：

(1)在玻璃衬底上制备稀土er³⁺离子掺杂上转换发光材料

采用旋涂法制备er³⁺掺杂ybmoo4复合薄膜：首先采用磁控溅射法和低温水溶液法在玻璃衬底表面依次制备ag层和zno阵列层，然后在其表面旋涂摩尔比为1:10的硝酸铒(er(no3)3·5h2o)和硝酸镱(yb(no3)3·5h2o)的乙醇溶液，随后再旋涂一层等量的与硝酸铒摩尔比为6:1的七钼酸铵((nh4)6mo7o24·4h2o)的水溶液，其中七钼酸铵水溶液的ph值通过1m的naoh溶液调至7。旋涂后获得的样品放入马弗炉中，在空气气氛下以3℃/min的速率升至500℃，并在该温度保持1h，保温结束并随炉冷却，即得到er³⁺掺杂ybmoo4复合薄膜。

(2)荧光染料浓度测定

将er³⁺掺杂ybmoo4复合薄膜附着在比色皿的一侧，比色皿中装有不同浓度的rhb水溶液(图3)。采用980nm激光激发er³⁺掺杂上转换复合薄膜，在比色皿另一侧通过光谱仪测量经过rhb溶液的er³⁺的上转换发光光谱(图1)。通过测量对应于er³⁺的²h11/2→⁴i15/2和⁴s3/2→⁴i15/2跃迁的两个绿色上转换发光强度iλ1(c)、iλ2(c)的比值r，建立与rhb浓度之间的关系，实现荧光强度比的rhb探测。

实施例2：

首先在玻璃衬底上制备稀土tm³⁺离子掺杂上转换发光材料，然后将薄膜附着在比色皿的一侧，比色皿中装有不同浓度的fitc水溶液。采用980nm激光激发tm³⁺掺杂上转换发光薄膜，在比色皿另一侧通过光谱仪测量经过fitc溶液的tm³⁺的上转换发光光谱(图2)。通过测量对应于tm³⁺的¹d2→³f4和¹g4→³h6跃迁的两个蓝色上转换发光强度的比值，建立与fitc浓度之间的关系，实现荧光强度比的fitc探测。

从图1和图2所示的实施例1和实施例2的稀土er³⁺/tm³⁺掺杂薄膜的上转换发光光谱和荧光染料rhb/fitc的吸收光谱可以看出，稀土er³⁺离子的绿色上转换发光(波长范围500-580nm内对应于²h11/2→⁴i15/2和⁴s3/2→⁴i15/2跃迁)和稀土tm³⁺离子的蓝色上转换发光(波长范围430-510nm内对应于¹d2→³f4和¹g4→³h6跃迁)分别与rhb和fitc的吸收光谱有较大程度的重叠，表明稀土er³⁺/tm³⁺离子和rhb/fitc荧光分子之间能够进行有效的能量传递。此外，由于荧光染料分子对不同波长入射光吸收不同(rhb和fitc的吸收光谱)，因此rhb和fitc分别对er³⁺的两个绿色上转换发光(²h11/2→⁴i15/2和⁴s3/2→⁴i15/2跃迁)和tm³⁺的两个蓝色上转换发光(¹d2→³f4和¹g4→³h6跃迁)具有明显不同的吸收系数(图中星形所示，吸收系数相差大约50％)。

从图3所示本发明实施例1的测量荧光染料浓度的系统示意图可以看出，在980nm红外激光激发下稀土掺杂薄膜发出的上转换发光一部分会被荧光染料分子再吸收，发生从稀土离子到荧光分子的能量传递，导致荧光染料分子被激发从而引起荧光染料的发光。接下来荧光染料的发光以及一部分未被荧光染料吸收的稀土离子上转换发光透射出比色皿后通过透镜聚焦进光谱仪进行光谱的采集。由于稀土掺杂上转换发光薄膜附着在比色皿的外壁而与比色皿中的荧光染料完全隔离，且隔离的距离至少大于比色皿的外壁厚度，因此稀土离子与荧光染料之间的能量传递不属于fret过程(fret过程要求能量的提供方和接受方之间的距离小于几个纳米)，而是属于ret过程。图4给出了实施例1的能量传递机理图，在980nm激光激发下，yb³⁺离子吸收光子能量从基态²f7/2能级跃迁至激发态²f5/2能级，然后再以能量转移(et)的方式将能量传递给er³⁺。er³⁺离子通过连续et过程在能级⁴f7/2上进行布居，随后无辐射弛豫至能级²h11/2和⁴s3/2后向⁴i15/2辐射跃迁，发出中心波长527和550nm的两个绿色上转换发光。er³⁺离子从能级⁴f9/2向能级⁴i15/2辐射跃迁发出中心波长662nm的红色上转换发光。接下来一部分绿光通过ret过程被rhb分子吸收，激发rhb分子从homo能级跃迁到lumo能级，最后染料分子从lumo能级辐射跃迁到homo能级，发出中心波长580nm的染料荧光。

从图5所示的本发明实施例1所测量得到的不同rhb浓度条件下er³⁺的上转换发光光谱可以看出，随着rhb染料浓度从0逐渐增加到1000ppm，er³⁺的两个绿色上转换发光峰强度逐渐降低，而红色上转换发光强度保持不变，同时在波长范围560-640nm内出现了rhb的发光峰，且rhb发光强度随着rhb浓度的增大逐渐增强。从图6所示的er³⁺的绿色上转换发光强度和rhb发光强度随rhb浓度的变化曲线可以看出，随着rhb浓度逐渐增大，er³⁺的绿色上转换发光强度(ih和is)以及强度之和(ih+is)逐渐降低，并且还可以观察到两个绿色上转换发光强度降低的趋势不一致。rhb的发光强度(irhb)随着rhb浓度的增大逐渐增强，但相比于er³⁺的绿色上转换发光强度，rhb的发光强度非常低，在rhb浓度小于100ppm时甚至探测不到rhb的发光。从图7a所示的两个绿色上转换发光强度比(r(ih/is))和rhb浓度(crhb)之间的对数关系曲线图可以看出，强度比r(ih/is)和rhb浓度crhb之间满足线性关系lnr＝0.096+0.0014crhb，拟合的确定系数r²＝0.99904，表明线性关系良好。从图7b所示的两个绿色上转换发光强度比(r(ih/is))和rhb浓度(crhb)之间的关系曲线图可以看出，强度比r(ih/is)和rhb浓度crhb之间满足r＝1.1007exp(0.0014crhb)，拟合的确定系数r²＝0.99937，表明er³⁺的绿色上转换发光强度比呈现出优良的rhb浓度传感特性。

为了进一步验证基于ret过程的荧光强度比技术在荧光染料探测上的应用，还可以采用er³⁺离子其它两个波段的上转换发光强度比进行rhb浓度探测。从图1和图5的er³⁺的绿色上转换发光光谱可以看到，发光峰出现了stark劈裂。将er³⁺的绿色上转换发光光谱按照stark劈裂进行分峰拟合，得到如图8所示的中心波长为521、525、531、544和553nm的5个stark发光峰。与图8给出的rhb吸收光谱进行对比可以看出，rhb荧光染料对于5个stark发光具有不同的吸收系数(图中星形所示)。图9给出的是本发明实施例1中对不同rhb浓度下er³⁺绿色上转换发光光谱进行stark发光峰拟合的结果，由图可见在rhb浓度较低的情况下(≤50ppm)，由于rhb发光太弱未能拟合出rhb的发光峰。从图10给出的本发明实施例1中er³⁺的两个不同stark发光峰强度比与rhb浓度之间的对数关系曲线可以看出，当用来实现荧光强度比的两个stark发光的吸收系数之差δk大于37％时(中心波长531和544nm的两个stark发光吸收系数之差)，两个stark发光强度比和rhb浓度之间满足良好的线性关系，且拟合的确定系数r²都很大，表明er³⁺的stark发光的强度比也呈现出良好的rhb浓度传感特性(图10e-j)。从图10e-j和公式(3)还可以看出，δk越大，拟合精度也越高，探测灵敏度s(即线性拟合的斜率)也越高。当用来实现荧光强度比的两个stark发光的吸收系数之差δk小于37％时，在rhb浓度较低时两个stark发光强度比和rhb浓度之间偏离线性关系，不能够实现良好的rhb浓度传感特性(图10a-d)。