一种快速筛选砷离子核酸适配体的方法及应用与流程

本发明属于环境安全监测领域，具体涉及一种能快速筛选砷离子核酸适配体的方法以及在砷离子检测中的应用。

背景技术：

砷是一种有毒重金属，对于动植物有强烈的毒害作用，在土壤、和水中可不断累积，造成严重污染。对于重金属的检测，当前已经发展了多种检测手段，如原子吸收光谱法、荧光法、电化学法、生物传感器法等方法。目前砷的检测方法有化学法与仪器法，化学法包括砷斑法、银盐法，由于化学法方法繁琐、灵敏度不高，不适应现代发展的需要；仪器法虽有较高的准确性，但其所需仪器昂贵，且需要专业人员的操作，很难满足现场快速检测的需要。

核酸适配体是一种对靶标分子具有高度特异性结合能力的功能核酸片段，已被广泛应用于重金属、毒素分子等多种物质的检测。指数富集的配体系统进化技术(selex)技术是筛选核酸适配体的一种主流技术。目前国际上基于该技术筛选了一条具有高度亲和力的as³⁺适配体,然而筛选所需的核酸文库巨大，筛选过程繁琐，费时费力，对操作人员有严格的技术要求。而所筛选的as³⁺适配体序列包含100个核苷酸，核苷酸链过长，合成成本较高，也影响载体表面的固定化，限制其在砷检测中的应用。因此，有必要发展一种简单快速的适配体筛选方法，对砷离子的适配体进行进一步的筛选和优化。

技术实现要素：

本发明为了解决上述问题，目的在于提供一种简便、快速的适配体筛选方法，对砷离子的核酸适配体进行快速优化，以克服现有适配体筛选技术耗时长、技术要求高的不足。

一种基于金纳米粒子的比色法反应体系，用于筛选最适合检测砷离子的核酸适配体序列，其特征在于，包括：核酸序列；纳米金溶液；以及氯化钠溶液，其中，核酸序列为

as-40：ttacagaacaaccaacgtcgctccgggtacttcttcatcg，

as-40-2：ttacagaacaaccaacccgggtacttcttcatcg，

as-40-4：tagggagataccagc，

as-40-6：ttacagaacaaccggtacttcttcatcg。

本发明提供的筛选砷离子适配体的比色反应体系，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，核酸序列的浓度为0.01～1.00μmol/l。

本发明提供的筛选砷离子适配体的比色反应体系，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，纳米金溶液的浓度为10～20nmol/l。

本发明提供的筛选砷离子适配体的比色反应体系，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，氯化钠溶液的浓度为0.1～0.9mol/l。

本发明提供的比色法检测砷离子的核酸序列反应体系，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，核酸序列为5’-ttacagaacaaccaacgtcgctccgggtacttcttcatcg-3’。

本发明提供的一种具有上述技术特征的筛选砷离子适配体的比色方法及利用所筛选适配体进行砷离子浓度检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，在向纳米金溶液中加入待筛选的核酸适配体溶液后混匀；

步骤二，将步骤一所得到的混合溶液和已知浓度的亚砷酸钠溶液混匀，并孵育一段时间后得到混合溶液；

步骤三，将步骤二中的混合溶液和特定浓度的氯化钠溶液混匀，室温反应5min，观察样品的颜色变化，拍照记录，并测定混合后的溶液对特定波长可见光的吸光度比值，得到砷离子浓度-吸光度比值标准曲线；

步骤四，将另外待筛选的核酸适配体溶液替换步骤二中的适配体溶液，重复步骤一、二、三，得到该适配体反应体系中的颜色变化照片以及对应的砷离子浓度-吸光度比值标准曲线；

步骤五，比较四种适配体反应体系的颜色变化以及砷离子浓度-吸光度比值标准曲线，可获得最适合检测砷离子的适配体。

步骤六，将未知浓度的砷离子溶液替换步骤二中已知浓度的亚砷酸钠溶液，重复步骤一、二、三，得到其在特定波长可见光的吸光度比值，根据该适配体体系的砷离子浓度-吸光度比值标准曲线，可获得待测溶液中的砷离子浓度。

本发明提供的适配体筛选方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤二和步骤三中混合的时间为5min，温度为室温25℃。

本发明提供的适配体筛选方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤三中的吸光度比值测定的波长为650nm、520nm，吸光度比值为a650/a520。

本发明还提供具有上述的技术特征的比色法检测砷离子的核酸序列反应体系在检测砷离子浓度中的应用，其特征在于：其中，砷离子为水溶液中的正三价砷离子，其浓度为0.01-1.00mmol/l。

发明作用与效果

根据本发明所提供的筛选砷离子适配体的比色反应体系，操作简单，辅助试剂：纳米金、氯化钠比较容易获得，可通过裸眼判断或者使用成本较低的分光光度计进行测量，大大降低了适配体的筛选难度；本发明筛选获得的适配体序列长度灵活，避免了pcr扩增引物的限制，有效缩短适配体序列长度，降低适配体的合成成本，有利于固定化应用。本发明提供的比色反应体系还可以用于进行砷离子的快速检测。

附图说明

图1为适配体as-40与不同浓度砷离子的反应结果照片；

图2为图1的砷离子浓度-吸光度比值曲线；

图3为适配体as-40-2与不同浓度砷离子的反应结果照片；

图4为图3的砷离子浓度-吸光度比值曲线；

图5为适配体as-40-4与不同浓度砷离子的反应结果照片；

图6为图5的砷离子浓度-吸光度比值曲线；

图7为适配体as-40-6与不同浓度砷离子的反应结果照片；以及

图8为图7的砷离子浓度-吸光度比值曲线。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明的砷离子核酸适配体的筛选反应体系的具体实例作具体阐述。

实施例

本实施例所用的核酸序列是使用已知的经典的亚磷酰胺三酯法进行化学合成的。其序列如下所示：

as-40：ttacagaacaaccaacgtcgctccgggtacttcttcatcg，

as-40-2：ttacagaacaaccaacccgggtacttcttcatcg，

as-40-4：tagggagataccagc，

as-40-6：ttacagaacaaccggtacttcttcatcg。

1、标准物质溶液的制备

称取不同质量的氯化钠用双蒸水配成不同浓度的氯化钠溶液(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/l)；合成的dna核酸序列(as-40、as-40-2、as-40-4、as-40-6)用双蒸水稀释成梯度浓度的适配体溶液(0、0.1、0.3、0.5、1μmol/l)；称取不同质量的亚砷酸钠用双蒸水配成所需浓度的亚砷酸钠溶液(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1mmol/l)。

2、适配体as-40对不同浓度砷离子的检测步骤

50μlaunps加入50μl浓度为0.1-1μm的适配体as-40溶液，混匀，室温反应5min；在其中加入50μl不同浓度的亚砷酸钠溶液(0-1mmol/l)，放置反应5min；最后加入10μl0.7mol/l的氯化钠溶液，使得溶液总体积为160μl，混匀，室温放置5min。观察实验结果颜色变化，拍照记录结果(图1)，并使用紫外可见光分光光度计测量特定波长的吸光度，计算波长为650nm和520nm的吸光度比值a650/a520，得到砷离子浓度-吸光度比值标准曲线(图2)。

3、适配体的筛选

将其它待筛选的适配体as-40-2，as-40-4和as-40-6分别替换实施例2中的适配体as-40，所得实验结果依次如图3-8所示。经过对比，得知适配体as-40的检测效果最佳。

4、砷离子的检测

50μl未知浓度的砷离子溶液(在0.1–0.5mmol/l范围内)代替实施例2中已知浓度的亚砷酸钠溶液，所得实验结果与对应适配体的标准曲线进行比对，得知所检测的砷离子浓度。

实施例的作用和有益效果

根据本实施例所提供的比色法筛选砷离子适配体的反应体系，筛选过程操作简单，筛选速度快，避免了pcr扩增，可以筛选较短的核酸序列，降低了适配体的合成成本，扩展了砷适配体的固定化应用；而且辅助试剂：纳米金、氯化钠也比较容易获得；另外本实施例提供的比色反应体系还可以用于检测砷离子，通过成本较低的分光光度计就可以测量，检测成本较低，适合快速检测。

本实施例中，砷离子为水溶液中的正三价砷离子(亚砷酸钠)，其浓度为为0.01-1.00mmol/l。