一种饲料中110种药物的筛查方法与流程

本发明属于饲料检测
技术领域：
，具体涉及一种饲料中110种药物的筛查方法。
背景技术：
：自moore等(1946)首次报道，在饲料中添加抗菌药物，能明显提高肉鸡的日增重。自此先后有60余种抗菌药物应用于畜牧业，在动物疾病防治、提高饲料利用率、促进畜禽生长等方面发挥了重要作用。但随着抗菌药物的大量使用，特别是不科学地滥用，细菌耐药性和药物残留等问题日益突出，引起世界各国政府及业内人士的高度重视。2006年，欧盟全面禁止了抗菌药物饲料添加剂的应用。我国是畜禽生产大国，在我国饲料生产过程中，使用抗菌药物的现象十分普遍。化学工业学会和制药工业学会2005年统计数据显示，我国每年抗菌药物原料生产量约为21万吨，其中有9.7万吨(占年总产量的46.1％)用于畜牧养殖业。使用抗菌药物的种类包括b一内酰胺类的阿莫西林、氨基糖苷类的庆大霉素和新霉素、大环内酯类的红霉素、林可胺类的克林霉素等。有报道指出全球每年消耗的抗菌药物总量中90％被用在食用动物身上，且其中90％都只是为了提高饲料转化率而作为饲料添加剂来使用。目前，饲料中使用抗菌药物问题主要是：1、在饲料中盲目、随意用药问题突出。我国养殖户(场)缺乏科学养殖技术和兽医知识，仅仅凭感觉用药；2、过量、长期使用抗菌药物；3、使用禁用抗菌药物现象时而发生；2000年以来，国家陆续公布了一些在畜禽生产中禁用的药物。如农业部2002年4月公布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》等。其中明文禁止氯霉素及其盐、酯(包括琥珀氯霉素)及制剂在所有食品动物作所有用途的使用。但在兽药监督检查或养殖场中时而能够看到，其使用依然禁而不止。4、人药兽用现象依然存在。《兽药管理条例》明令禁止人药兽用。在生产中，由于兽药抗菌药物的品种较少，或人们担心兽药的质量，往往使用医用药物。5、不按规定休药期使用。休药期的长短与药物在动物体内的消除率和残留量有关，而且与动物种类、用药剂量和给药途径有关。国家对有些兽药特别是药物饲料添加剂都规定了休药期，但是部分养殖户(场)使用含药物添加剂的饲料时很少按规定休药期执行。由于上述原因，从而增加了细菌耐药性的机会，直接或间接地危害了人类的身体健康，破坏了生态环境。因此，饲料的质量安全是人类食品安全的基础，建立饲料中抗菌类药物快速有效的检测方法是非常必要的。目前国内外现有的药物多残留检测方法主要有液相色谱法、液相色谱串联飞行时间质谱法和液相色谱串联质谱法等方法。现存的检测方法对单一种类药物研究已相对较为成熟，药物多残留的检测方法建立时需要考虑的因素较多，各药物的物理化学性质差异，前处理方法较为复杂，存在灵敏度低、药物种类覆盖面窄等缺点。基于药物多残留技术具有的特殊监测和预警优势，近年来，我国各科研单位也逐渐重视药物多残留检测技术的研究。目前国内同时测定畜产品中多残留药物并对其准确定量的方法较为缺乏，因此急需建立一种同时测定多种药物残留的检测技术。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供一种饲料中110种药物的筛查方法，为饲料中添加残留抗菌药物提供了一种完整的检测方法，丰富了国家行业残留检测标准，增加了抗菌药物筛查技术手段，为国家饲料产品及绿色养殖提供安全保障。本发明的目的是以下述技术方案实现的：一种饲料中110种药物的筛查方法，具体包括以下步骤：所述的110种抗菌药物为：(a)、大环内酯类：泰乐菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、那他霉素、竹桃霉素、螺旋霉素i、吉他霉素；(b)、氟喹诺酮类：恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、麻保沙星、奥比沙星、氟甲喹、萘啶酸、西诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氟罗沙星；(c)、磺胺类：磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺硝苯、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噻唑；(d)、喹噁啉类：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；(e)、β-内酰胺类：氨苄西林、苯唑西林、氟氯西林、头孢匹林、头孢噻肟、头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻呋；(f)、林可胺类：林可霉素、克林霉素；(g)、四环素类：土霉素、四环素、金霉素、多西环素；(h)、酰胺醇类：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；(i)、硝基呋喃类：呋喃唑酮、呋喃它酮；(j)、硝基咪唑类：奥硝唑、地美硝唑、异丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；(k)、抗球虫类：氯苯胍、氯羟吡啶；(l)、苯并咪唑类：非班太尔、氟苯达唑、阿苯达唑、芬苯哒唑、奥苯达唑、奥芬哒唑、噻苯达唑、阿苯达唑砜、甲苯达唑；(m)、β-受体激动剂：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉贝特罗、班布特罗、喷布特罗、溴布特罗；(n)、镇静剂类：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、异丙嗪、赛拉嗪、奥沙西泮、硝西泮、地西泮、奋乃静；(o)、抗病毒类：金刚烷胺、金刚乙胺、泛昔洛韦；(p)、其他：甲氧苄啶、阿托品；(1)标准工作溶液的配制：准确称取各标准品10mg，于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1mg/ml各标准贮备液；对于难溶药物，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星加入少量0.1mol/lhcl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/lnaoh溶液，头孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加适量二甲基亚砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；分别量取各标准贮备液1ml，于100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml混合标准中间工作溶液；取混合标准中间工作液0.1ml，用乙腈+水混合液稀释，制成1μg/ml混合标准工作液；(2)待测样品的分析前处理：1)称取2±0.02g试样于50ml离心管中，加入6ml提取液，涡旋30s，振荡提取10min，以8000r/min的速度离心5min，移取上清液于10ml离心管中；残渣用4ml乙腈重复提取，离心后合并上清液，作为备用液；2)氨基固相萃取柱，用6ml乙腈活化，移取备用液过柱，收集流出液，用50％乙腈溶液定容至5ml，混匀，过0.22μm微孔尼龙滤膜；(3)数据库建立：确定110种药物的分子式和分子量，将110种药物的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱测定，得到混合标准工作液的总离子流图，再把每种药物的离子色谱图提取出来，确定每种药物的保留时间；将药物的分子量和保留时间输入msms分析系统，对混合标准工作液进行msms分析，得到各药物的子离子扫描质谱图，并根据各药物的碎片的断裂机理和断裂难度，确定各药物的特征碎片离子；将各药物的种类、名称、分子式、保留时间和特征碎片离子信息汇总，建立110种药物筛查数据库，如下表所示：表1数据库(4)定性分析：1)对经过步骤(2)所述方法处理的待测样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的结果与数据库中的数据进行比较，空白溶剂不能出现与标准溶液相同的离子峰，试样的母离子及特征碎片离子的精确质量数应与标准溶液的一致，偏差均应≤0.05da，试样色谱峰的保留时间，应与标准溶液的保留时间一致，容许偏差为±0.2min，母离子与碎片离子色谱峰的信噪比(s/n)都在3:1以上，信噪比以峰对峰(ptp)计算，全扫描光谱记录时，试样中特征碎片离子的相对丰度必须超过标准溶液参照的特征离子光谱丰度的10％，筛选出满足定性条件的药物，即为疑似阳性样品；2)对于疑似阳性样品，根据药物的保留时间和分子量编辑msms方法，并采集数据，所得到的疑似物质的子离子扫描质谱图，与标准溶液的子离子扫描质谱图进行比较，在相同的条件和相近的浓度下，试样中主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差不超过下表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物：表2主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差所述步骤(3)和步骤(4)中的液相色谱分析条件为：采用watersuplctmbehc18色谱柱，2.1mm×100mm，1.7μm，有机相比例从初始的2％缓慢变化到95％，以保证所有药物都能有效检出，梯度洗脱程序见下表3：表3色谱梯度洗脱程序注：esi+：a：0.1％甲酸溶液；b：乙腈，梯度洗脱；esi-：a：水；b：乙腈，梯度洗脱；1为即时变化，6为线性变化。所述步骤(3)和步骤(4)中的质谱分析条件如下表所示：表4离子源参数表5筛查质谱方法参数注：亮氨酸脑啡肽实时在线分子量校正，分子量为556.2771(esi+)/554.2615(esi-)，扫描时间0.5s，扫描间隔10s。所述步骤(1)中乙腈和水的混合液的乙腈和水的体积比为1:1。所述步骤(2)中的提取液为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为1:1。还包括对110种药物的检测限的测定，测定方法为：添加10μg/ml标准溶液100μl于2g空白饲料中，经提取后测定，药物的信噪比s/n＞3，表明各药物的检测限为0.5mg/kg。本发明利用液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱仪，高灵敏度的msms功能，能够精确的测定出药物中母离子与子离子，快速的判断出添加的药物成分。该方法应用范围广泛，同时又建立了饲料中多种抗菌药物的检测方法，针对我国饲料行业添加多种抗菌药物具有高效、准确精密的检测手段，目前属于国内领先水平。本发明建立的筛查方法，大大提高了饲料行业中乱填乱加的现象，为检测部门完善了更加精密准确的检测方法，省去更多的时间，节省了大部分的实验耗材，对食品安全及人类健康生活有不可估量的贡献。附图说明图1是混合标准溶液的总离子流图(esi+)。图2是恩诺沙星的提取离子色谱图(esi+)。图3是恩诺沙星标准溶液子离子扫描质谱图。图4是林可霉素标准溶液特征碎片离子提取色谱图。图5是林可霉素标准溶液母离子提取色谱图。图6是样品1中林可霉素特征碎片离子提取色谱图。图7是样品1中林可霉素母离子提取色谱图。图8是林可霉素标准溶液二级碎片离子质谱图。图9是样品1中林可霉素二级碎片离子质谱图。图10是阿苯达唑标准溶液特征碎片离子提取色谱图图11是阿苯达唑标准溶液母离子提取色谱图。图12是样品5中阿苯达唑特征碎片离子提取色谱图。图13是样品5中阿苯达唑母离子提取色谱图。图14是阿苯达唑标准溶液二级碎片离子质谱图。图15是样品5中阿苯达唑二级碎片离子质谱图。图16是互补的两种或几种固相萃取柱配合使用的思路的示意图。图17是carb和nh2配合使用时的流程示意图。具体实施方式所述饲料为配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料。所述的110种抗菌药物为：(a)、大环内酯类(11种)：泰乐菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、那他霉素、竹桃霉素、螺旋霉素i、吉他霉素；(b)、氟喹诺酮类(17种)：恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、麻保沙星、奥比沙星、氟甲喹、萘啶酸、西诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氟罗沙星；(c)、磺胺类(20种)：磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺硝苯、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噻唑；(d)、喹噁啉类(4种)：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；(e)、β-内酰胺类(8种)：氨苄西林、苯唑西林、氟氯西林、头孢匹林、头孢噻肟、头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻呋；(f)、林可胺类(2种)：林可霉素、克林霉素；(g)、四环素类(4种)：土霉素、四环素、金霉素、多西环素；(h)、酰胺醇类(3种)：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；(i)、硝基呋喃类(2种)：呋喃唑酮、呋喃它酮；(j)、硝基咪唑类(5种)：奥硝唑、地美硝唑、异丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；(k)、抗球虫类(2种)：氯苯胍、氯羟吡啶；(l)、苯并咪唑类(9种)：非班太尔、氟苯达唑、阿苯达唑、芬苯哒唑、奥苯达唑、奥芬哒唑、噻苯达唑、阿苯达唑砜、甲苯达唑；(m)、β-受体激动剂(8种)：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉贝特罗、班布特罗、喷布特罗、溴布特罗；(n)、镇静剂类(10种)：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、异丙嗪、赛拉嗪、奥沙西泮、硝西泮、地西泮、奋乃静；(o)、抗病毒类(3种)：金刚烷胺、金刚乙胺、泛昔洛韦；(p)、其他(2种)：甲氧苄啶、阿托品。1.标准工作溶液的配制：准确称取各标准品10mg，于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1mg/ml各标准贮备液；对于难溶药物，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星加入少量0.1mol/lhcl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/lnaoh溶液，头孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加适量二甲基亚砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；分别量取各标准贮备液1ml，于100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml混合标准中间工作溶液；取混合标准中间工作液0.1ml，用乙腈+水混合液稀释，制成1μg/ml混合标准工作液。2.待测样品的分析前处理：2.1取粉碎后的供试样品，作为供试试样。2.2常温干燥贮存备用。2.3提取液筛选及样品提取2.3.1提取溶剂的选择参考相关文献，我们考察了乙腈、甲醇和水这三种较常用的溶液。分别比较了乙腈及甲醇不同比例水溶液进行提取的效果，发现乙腈+水和甲醇+水作为提取液，药物的提取效果都比较理想。但甲醇+水的沉淀效果较差，提取液浑浊难净化，所以选用提取效率高并且沉淀效果好的乙腈+水作为提取液。在比较了不同比例乙腈水的回收率后，最终采用6ml水+乙腈(50+50,v/v)提取，残渣用4ml乙腈重复提取。2.3.2称取2g试样(精确到0.01g)于50ml离心管中，加入6ml水+乙腈(50+50,v/v)，涡旋30s，振荡提取10min，以8000r/min的速度离心5min，移取上清液于10ml离心管中。残渣用4ml乙腈重复提取一次，离心，合并上清液，作为备用液。2.3.3净化条件的确定根据实验情况，我们设计了以下几种净化方案：1)提取液直接净化除脂a.nh2柱：乙腈活化→上样→收集过柱液→氮吹→定容。b.碳黑柱：二氯甲烷、甲醇活化→上样→收集过柱液→氮吹→定容。c.氧化铝柱(酸性、中性、碱性)：乙腈活化→上样→收集过柱液→氮吹→定容。d.正己烷除脂。2)提取液经氮气吹干，加水溶解后过固相萃取柱净化，洗脱液氮气吹干后定容过滤上机，考察净化及保留效果。主要考察了max、mcx、hlb、scx、碳黑等常见固相萃取柱。处理方法如下：a.max：甲醇、水活化→上样→水、甲醇淋洗→5％甲酸甲醇洗脱。b.mcx、scx：甲醇、水活化→上样→水、甲醇淋洗→5％氨化甲醇洗脱。c.hlb:甲醇、水活化→上样→水淋洗→甲醇洗脱。d.carb：二氯甲烷、甲醇、水活化→上样→甲醇洗脱。3)由于这些萃取柱选择性较强，而药物的性质差异很大，一种小柱不可能对所有药物均有保留，因此我们考虑将互补的两种或几种固相萃取柱配合使用，思路如附图16所示。例如，carb和nh2配合使用时的流程图如附图17所示。分别考察了正己烷除脂及固相萃取柱净化等方法，由于正己烷与乙腈有一定的互溶性，故采用乙腈饱和正己烷进行除脂，发现回收率较低，原因可能为基质中干扰成分去除不完全，仍对检测造成干扰，或者为在除脂过程中一部分目标物溶入正己烷层，造成一定的损失。考察了scx柱、mcx柱、max柱及hlb柱对，由于各类药物活性基团不同，保留效果差异较大，如scx柱对大环内酯类回收率在64％～92％之间，但对磺胺类药物却没有保留。分别考察了氨基柱，氧化铝(中性、碱性和酸性)柱及碳黑柱对各药物的回收率。结果表明，氧化铝小柱对四环素和喹诺酮类药物回收率极低，碳黑柱对喹诺酮类药物收率较差，而氨基柱对蛋白质有一定的保留，达到了净化的目的，同时所有药物均有较好的回收，能够满足实验的要求。最终确定净化方法为：氨基固相萃取柱，用6ml乙腈活化，移取备用液过柱，收集流出液，用50％乙腈溶液定容至5ml，混匀，过0.22μm微孔尼龙滤膜。3.仪器参数设定3.1液相色谱参考条件色谱柱：watersuplctmbehc18柱，柱长100mm，柱内径2.1mm，粒度1.7μm或相当的分析柱。柱温：40℃。流动相：esi+：a相：0.1％甲酸溶液，b相：乙腈，梯度洗脱。esi-：a相：水；b相：乙腈，梯度洗脱。梯度洗脱程序见表3-1。流速：0.45ml/min。进样量：2μl。表3-1色谱梯度洗脱程序注：1为即时变化，6为线性变化。3.2质谱分析条件由于涉及的药物种类多，且药物性质差异大，不可能每种药物都达到最佳检测条件。经过优化后，最终确定离子源参数筛查质谱方法参数，分别如表3-2、表3-3所示，在此条件下，大部分药物都有较好的响应。表3-2离子源参数表3-3飞行时间质谱方法参数注：亮氨酸脑啡肽实时在线分子量校正，分子量为556.2771(esi+)/554.2615(esi-)，扫描时间0.5s，扫描间隔10s。4.数据库的建立：确定110种药物的分子式和精确分子量，将各药物的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱测定，得到混合标准工作液的总离子流图，如图1所示；再把每种药物的离子色谱图提取出来，确定每种药物的保留时间，以恩诺沙星为例，提取结果如图2所示；将药物的分子量和保留时间输入msms分析系统，对混合标准工作液进行msms分析，得到各药物的子离子扫描质谱图，以恩诺沙星为例，恩诺沙星的子离子扫描质谱图如图3所示，并根据各药物的碎片的断裂机理和断裂难度，确定各药物的特征碎片离子；将各药物的种类、名称、分子式、保留时间和特征碎片离子信息汇总，建立122中非处方药物筛查数据库，如下表所示：表4-1数据库5.对经过步骤2所述方法处理的待测样品进行液相色谱-串联质谱分析测定，进样顺序为：溶剂空白进1针；标准工作液进1针，其rsd<10％，确定系统是否在允许误差之内；溶剂空白进1针；样品1进1针；溶剂空白进1针；…………交替进行；…………试剂空白进1针；标准工作液进1针；…………注：顺序的任何调整应有充分理由证明其合理性。6.定性分析和结果确证6.1定性分析将步骤5得到的结果与数据库中的数据进行比较，空白溶剂不能出现与标准溶液相同的离子峰，试样的母离子及特征碎片离子的精确质量数应与标准溶液的一致，偏差均应≤0.05da，试样色谱峰的保留时间，应与标准溶液的保留时间一致，容许偏差为±0.2min，母离子与碎片离子色谱峰的信噪比(s/n)都在3:1以上，信噪比以峰对峰(ptp)计算，全扫描光谱记录时，试样中特征碎片离子的相对丰度必须超过标准溶液参照的特征离子光谱丰度的10％，筛选出满足定性条件的药物，即为疑似阳性样品。6.2结果确证对于疑似阳性样品，根据药物的保留时间和分子量编辑ms/ms方法，并采集数据，所得到的疑似物质的子离子扫描质谱图，与标准溶液的子离子扫描质谱图进行比较，在相同的条件和相近的浓度下，试样中主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差不超过下表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物：表6-1主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差相对离子丰度(％)>50>20～50>10～20≤10允许的最大偏差(％)±20±25±30±507.实际样品检测用上述方法对待测样品进行检测，结果如表7-1所示，阳性结果见图4-15。表7-1实际样品检测结果样品编号饲料名称样品来源检出非处方成分1鸡配合料养殖场林可霉素2鸡浓缩料饲料企业未检出3猪预混料养殖场未检出4猪浓缩料养殖场未检出5猪配合料饲料企业阿苯达唑8.检测限的确定为了不引起仪器的污染，在样品上机测定之前，对样品至少稀释1000倍后测定。由于注射液、溶液及可溶性粉经提取液稀释后，上机测定的溶液与标准品的溶液基本等同。因此，我们将各种药物标准品的检测限定为本方法的检测限。添加10μg/ml标准溶液100μl于2g空白饲料中，经提取后测定，药物的信噪比s/n＞3，表明各药物的检测限为0.5mg/kg。9.回收率实验选择空白配合饲料、浓缩饲料及预混合饲料样品做为测试对象，进行加标试验。在0.5mg/kg浓度进行加标回收率实验，3次平行实验，计算相对标准偏差。110种药物的平均回收率和相对标准偏差见表9-1。表9-1添加回收率试验结果以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。当前第1页12