一种检测汞离子的电化学传感器的制作方法

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及检测二价汞离子的生物传感器。

背景技术：

作为全球性环境污染物，汞具有致畸、致癌作用，是蓄积性毒物，有生物不可降解性，其人为释放及其对生态系统功能和人类健康的影响受到国际社会的普遍关注。汞污染大多数来源于固体废物焚烧和化石燃料的燃烧，能在大气中长期稳定存在，从而严重污染了一些水源和土壤。而且，无机汞能在海洋环境中的一些微生物作用下转化为毒性更大的甲基汞，并在食物链的各个环节中积累，最终通过食物链进入人体，会沉积在脑、肝和其它器官中，产生慢性中毒，损害肾、脑、胃和肠道,甚至引起死亡。汞是一种剧毒的全球性环境污染物，严重危害环境和人类健康。因此，对环境、食品中痕量汞的检测十分重要，简单快速、高灵敏、高选择性的检测汞的方法备受关注。

目前测定汞常用方法主要有冷原子吸收法、冷原子荧光法、色谱法和等离子体电感耦合质谱法，虽然这些方法的准确度较高，但往往需要大型的仪器设备，且成本比较高，处理过程繁琐耗时，不能满足实际监测中高效低成本的需要。而现存汞离子传感技术还在起步阶段，开发出更灵敏、更简单快捷的汞离子的检测技术依旧是摆在人们面前的一大挑战。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测汞离子的电化学传感器，本发明利用“t-hg²⁺-t”的复合结构实现了对目标物汞离子的高特异性检测，利用核酸外切酶三对dna双链3'端的切割作用，实现了目标物的循环利用，另外采用滚环复制放大技术，起到了信号放大，并利用亚甲基蓝的氧化还原特性构建了电化学生物传感器。本发明对“t-hg²⁺-t”的复合结构和rca进行结合应用，使信号检测更为灵敏和快速，使得制备的生物传感器具有操作简单、快速、灵敏度高等特点。

本发明一共用了3条dna链：

captureprobe:5′-cctccctgtccgatcctcaaag-(ch2)6-thiol-3′（seqidno.1）；

padlock:5′-ctgtccgatcctcttccttgaaacttcttcctttctttcggctgtcctcc-3′(seqidno.2)；

hap:5′-ctttgaggatcggacagggaggacagcccgatcctctttg-3′(seqidno.3)。

其中发夹结构的序列中，未杂交的两端可以与目标物特异性的识别并紧密结合形成t-hg2+-t稳定结构。由于该链两端的碱基是完全互补的，因此可以杂交形成稳定的发夹形二级结构。

captureprobe的3’端修饰有巯基（-sh），可以与金电极形成稳定的au-s键，从而将captureprobe固定在电极表面。

padlock的5’端修饰有磷酸基团，它可以在t4连接酶的作用下形成环状物，进而与引物杂交进行rca扩增。

本发明中用到了三种酶：phi29dna聚合酶和核酸外切酶三以及t4连接酶。phi29dna聚合酶同时具有链延伸和置换功能，核酸外切酶三可以对dna双链的3'端的平末端进行切割，t4连接酶可以将挂锁探针连接成环状结构进行滚环复制放大。

本发明中二价汞离子的检测传感器制备是在均相溶液中实现的，通过目标循环放大及滚环扩增方式来实现信号的放大，从而实现汞离子的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：发夹结构的dna在有目标物存在的情况下，能够形成稳定的“t-hg²⁺-t”的复合结构。此时均相中的外切酶三就可以水解dna双链3'端，使目标物成游离的状态，并可进一步结合其他的发夹结构，实现第一次循环放大，即目标物的循环利用。释放出的单链作为二级目标物与挂锁探针杂交，在t4连接酶作用下，挂锁探针形成环状结构，此时在phi29dna聚合酶与dntp的共同作用下，以挂锁探针为模板、以二级目标物为引物发生链延长，实现第二次循环放大。

在均相反应中，两步放大的反应条件均为37℃，反应时间是2h。

具体技术方案如下：

1）金电极首先在0.3μm和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗；

2）将10μl的10μm的captureprobe滴加到电极表面，在室温下孵育2h；通过au-s键将巯基链固定到电极表面；

3）均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10x的缓冲液buffer，2μl外切酶三、2μl浓度为1μm的hap和2μl目标物加入到预先准备好的灭菌的离心管中；震荡30s，然后将混匀的混合液放入30℃的恒温箱中孵育50min；

b、继续向a步的离心管中加入2μl10μmpadlock，1μlt4链接酶，2μlphi29聚合酶和2μldntp；震荡30s，然后将混匀的混合液继续放入37℃的恒温箱中孵育1h；

c、将b步反应后的溶液滴加到预先修饰好captureprobe的电极上;然后将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育1h；

d、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

e、将清洗好的电极浸泡在8×10^-5m的亚甲基蓝溶液中10min；

f、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。ag/agcl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过au-s键将captureprobe固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，在37℃孵育2h使均相中的rca产物与电极表面的captureprobe完成杂交反应，从而使rca产物固定到电极表面。然后将电极浸泡在亚甲基蓝溶液中10分钟，用三电极工作体系检测mb的氧化还原峰。

本发明具有如下的技术效果：

1、利用“t-hg2+-t”的复合结构实现了对目标物汞离子的高特异性检测；

2、利用核酸外切酶三对dna双链3'端的平末端的水解作用，实现了目标物的循环利用，起到了信号放大的作用；

3、利用rca滚环放大技术实现了第二步循环放大。信号的两次循环放大实现了对目标物的高灵敏检测，提高了检测的灵敏度；

4、该传感器的反应条件温和，反应速度快。

附图说明

图1为本发明的反应原理图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1）金电极首先在0.3μm和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗；

2）将10μl的10μm的captureprobe滴加到电极表面，在室温下孵育2h；通过au-s键将巯基链固定到电极表面；

3）均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，10x的缓冲液buffer，2μl外切酶三、2μl浓度为1μm的hap和2μl目标物（浓度分别为500nm,200nm，100nm，1nm，500pm，100pm）加入到预先准备好的灭菌的离心管中；震荡30s，然后将混匀的混合液放入30℃的恒温箱中孵育50min；

b、继续向a步的离心管中加入2μl10μmpadlock，1μlt4链接酶，2μlphi29聚合酶和2μldntp；震荡30s，然后将混匀的混合液继续放入37℃的恒温箱中孵育1h；

c、将b步反应后的溶液滴加到预先修饰好captureprobe的电极上;然后将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育1h；

d、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

e、将清洗好的电极浸泡在8×10^-5m的亚甲基蓝溶液中10min；

f、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

g、以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5v，脉冲宽度0.05v，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安技术读取mb电信号的变化，检测目标物。具体原理图如附图1。

上述过程中用到的溶液：

1、pbs缓冲液是由方法配制：na2hpo4(10mm)，nah2po4(10mm),nacl(140mm),kcl(1mm),mgcl2(1mm),cacl2(1mm),最终溶液的ph值为7.4。

2、10x的缓冲液（buffer）是随外切酶一起买来的，可直接使用。

3、配置的pbs缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将pbs和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。

本发明提供的传感器，在浓度为500nm,200nm，100nm，1nm，500pm，100pm的范围内检测结果呈线性分布，也就是，在这一检测浓度范围内，其检测结果是准确，稳定的。

<110>济南大学

<120>一种检测汞离子的电化学传感器

<160>2

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>1

cctccctgtccgatcctcaaag22

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(50)

<223>引物

<400>2

ctgtccgatcctcttccttgaaacttcttc30

ctttctttcggctgtcctcc50

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(40)

<223>引物

<400>3

ctttgaggatcggacagggaggacagcccg30

atcctctttg40