一种跌打丸质量标准检测方法与流程

本发明涉及属于中药技术领域，具体是一种跌打丸质量标准检测方法。

背景技术：

跌打丸是骨伤科常用的中成药，由三七、红花、血竭、骨碎补、乳香、没药、甘草等24种中药研制而成，具有活血散淤、消肿止血之功效，主治跌打损伤、瘀血肿痛、闪腰岔气等症，一般多用于内服。

跌打丸为天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂生产的药品，其质量标准收载于《中华人民共和国药典》2015版一部。现跌打丸质量标准中血竭素含量测定的方法为高效液相色谱法，该方法采用3％磷酸甲醇25ml加热回流提取30min，经过方法学考察与验证后，发现此方法对跌打丸中血竭素含量提取不充分，并且血竭素在磷酸中稳定性差，从而导致跌打丸的血竭素含量合格率低。

本发明重新研究了跌打丸质量标准检测方法，能够提高检测方法的准确度和稳定性，为跌打丸的质量标准检测提供了新的思路。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提供一种跌打丸质量标准检测方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种跌打丸质量标准检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取血竭素高氯酸盐对照品，精密称定，加3％盐酸甲醇制成每1ml含血竭素高氯酸盐20μg的溶液，相当于血竭素14.52μg，即得；

(2)供试品溶液的制备：取样品适量，剪碎，取2g，精密称定，精密加入3％盐酸甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流15min，放冷，再称定重量，用3％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液，即得；

(3)阴性样品溶液的制备：按处方称取血竭素的各味药材，按处方工艺制得样品，再按照所述步骤(2)供试样品溶液的制备方法，制得阴性样品溶液；

(4)分别精密吸取供试样品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，即得。

进一步地，所述步骤(4)的色谱条件如下：

色谱柱：glinertsilods-3，250mm×4.6mm，5μm；

流动相：乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钠溶液，两者体积比为49：51；

柱温：35℃；

流速：0.8ml/min；

检测波长：440nm；

理论板数按血竭素峰计算应不低于4000。

进一步地，所述步骤(2)中的样品为小蜜丸或大蜜丸。

进一步地，所述小蜜丸每10丸重2g；所述大蜜丸每丸重3g。

进一步地，所述步骤(4)中注入高效液相色谱的溶液为10μl。

进一步地，所述样品含血竭以血竭素计，小蜜丸每1g不得少于0.10mg，大蜜丸每丸不得少于0.30mg。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)采用本发明的方法，能够提高血竭素在盐酸中的稳定性，跌打丸中血竭素含量被充分提取，避免血竭素含量合格率低，提高检测方法的准确性与稳定性。

(2)采用本发明的方法，有效排除了其他杂质的干扰，稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握，检测起来更加方便、快捷。

附图说明

图1为对照品色谱图(glinertsil)。

图2为供试品色谱图(glinertsil)。

图3为阴性色谱图(glinertsil)。

图4为血竭素标准曲线。

图5为对照品色谱图(迪马柱)。

图6为供试品色谱图(迪马柱)。

图7为对照品色谱图(菲罗门柱)。

图8为供试品色谱图(菲罗门柱)。

具体实施方式

方法学考察

1.1仪器和试剂

仪器：岛津lc-20ad高效液相色谱仪。

试剂：乙腈(色谱纯，fish公司)，甲醇(色谱纯，fish公司)，盐酸(分析纯，天津科密欧化学试剂科贸公司，纯度35-37％)，磷酸二氢钠(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为纯化水。

对照品：血竭素高氯酸盐(中国食品药品检定研究院购置，批号：110811-201506，供含量测定用，纯度为98.6％)，

跌打丸：天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂(批号：4510031、4510033、4510038、4510039、4510040、4510043、4510044、4510046、4518001、4518002、4518003)。

1.2色谱条件

色谱柱：glinertsilods-3，250mm×4.6mm，5μm；

流动相：乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钠溶液，两者体积比为49：51；

柱温：35℃；

流速：0.8ml/min；

检测波长：440nm；

理论板数按血竭素峰计算应不低于4000。

1.3提取溶剂的选择

取同一批号(4510046)样品适量，剪碎，取2g，精密称定，分别精密加入3％磷酸甲醇溶液25ml和3％盐酸甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，分别补足减失的重量，摇匀，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，分别在0h、4h、8h、12h、18h、24h进样，峰面积见表1。

表1提取溶剂的考察

结果表明，用盐酸甲醇做提取溶剂时血竭素含量高于用磷酸甲醇作为提取溶剂，并且用磷酸作为提取溶剂时，日间稳定性差，rsd超过了规定范围3％，而盐酸甲醇的rsd则合格，日间稳定性好，故把提取溶剂改为3％盐酸甲醇进行下一步考察。

1.4提取方法的考察与确定

1.4.1提取方式与提取时间的考察

取同一批号(4510046)样品适量，剪碎，取2g，精密称定，精密加入3％盐酸甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，分别采用加热回流法、超声波法与震荡法三种提取方式，时间分别为15min、30min、45min、60min，放冷，再称定重量，用3％盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，测定样品中的血竭素含量，结果见表2。

表2血竭素提取方法与时间的比较

结果表明，加热回流法提取15min时血竭素含量最高，随着加热时间增加，血竭素含量逐渐降低，由此可推断出，血竭素对热不稳定，加热时间过长会破坏血竭素含量，故选择采用加热回流法提取15min的方式进行提取。

1.4.2提取溶剂浓度的考察

对照品溶液的制备：取血竭素高氯酸盐对照品适量，精密称定，分别加入0.5％、1％、3％、6％、9％的盐酸甲醇溶液配制成每1ml含血竭素高氯酸盐20μg的溶液(相当于血竭素14.52μg)，即得。

供试品溶液的制备：取同一批号(4510046)样品适量，剪碎，取2g，精密称定，分别精密加入0.5％、1％、3％、6％、9％盐酸甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，采用加热回流提取方式，时间为15min，放冷，再称定重量，分别用0.5％、1％、3％、6％、9％盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，进行测定，分别用相对应浓度的盐酸甲醇对照品和样品计算血竭素含量，结果见表3。

表3提取溶剂浓度的比较

结果表明，提取溶剂浓度为3％时，血竭素含量最高，随着溶剂浓度增加，血竭素含量逐渐减小，由此可推断出，高浓度的盐酸甲醇对血竭素有破坏性，因此提取溶剂浓度确定为3％。

1.4.3提取溶剂用量的考察

取同一批号(4510046)样品适量，剪碎，取2g，精密称定，分别精密加入3％盐酸甲醇溶液15ml、25ml、50ml、75ml，密塞，称定重量，加热回流15min，放冷，再称定重量，用3％盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，测定样品中血竭素含量，结果见表4。

表4提取溶剂用量的比较

结果表明，随着溶剂用量逐渐增大，含量也逐渐增大提，取越充分，直到盐酸甲醇加入量为50ml后，含量趋于稳定，故提取溶剂用量应采用50ml盐酸甲醇。

1.4.4方法确定

综上所述，高热与强酸都对血竭素含量有影响，在经过严密的方法学考察后，决定把原提取方法改为：“使用3％盐酸甲醇溶液50ml加热回流15min，放冷，再称定重量，用3％盐酸酸甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液”为新法进行方法学验证。

方法学验证

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备：取血竭素高氯酸盐对照品，精密称定，加3％盐酸甲醇制成每1ml含血竭素高氯酸盐20μg的溶液，相当于血竭素14.52μg，即得；

2.1.2供试品溶液的制备：取样品适量，剪碎，取2g，精密称定，精密加入3％盐酸甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，加热回流15min，放冷，再称定重量，用3％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液，即得；

2.1.3阴性样品溶液的制备：按处方称取血竭素的各味药材，按处方工艺制得样品，再按照“2.1.2”供试样品溶液的制备方法，制得阴性样品溶液；

2.2专属性试验

分别精密吸取上述三种溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，结果见图1、2、3。

结果表明，在供试品色谱上有一个与对照品对应的色谱峰，即血竭素峰，且峰形良好，而阴性样品色谱中无该色谱峰，表明阴性无干扰，本方法具有良好的专属性。

2.3标准曲线的制备

2.3.1血竭素标准曲线

取血竭素高氯酸盐对照品适量，精密称定，加3％盐酸甲醇制成每1ml中分别含血竭素高氯酸盐5.24、10.48、20.96、52.4、104.8、209.6μg的对照品溶液，分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定血竭素高氯酸盐峰面积，结果见表5。

表5血竭素标准曲线

以对照品的进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，计算回归方程及相关系数：结果可知，血竭素高氯酸盐的回归方程为：y＝2e+06x+10707相关系数r＝0.9999。

结果表明，血竭素高氯酸盐进样量在0.0524～2.096μg范围内线性良好，即血竭素进样量在0.0375～1.501μg范围内线性良好，其标准曲线见图4。

2.4进样重复性试验

取同一批号(4510003)适量，剪碎，取2g，精密称定，精密加入3％盐酸甲醇50ml，按照“2.1.2”供试品溶液制备操作，连续进样6次，测定血竭素高氯酸盐峰面积，结果见表6。

表6进样重复性试验

结果表明，样品中血竭素高氯酸盐峰面积平均值为203053.5，rsd为0.72％，符合药典规定。

2.5重现性试验

取同一批号(4510003)适量，剪碎，取2g，精密称定，共6份，分别精密加入3％盐酸甲醇50ml，按照“2.1.2”供试品溶液制备操作，测定样品中的血竭素含量，结果见表7。

表7重现性试验

结果表明，样品中血竭素含量平均值为0.5437mg/丸，即0.1812mg/g,rsd为2.11％，符合药典要求，表明本方法具有良好的重复性。

2.6日间稳定性试验

取同一批号(4510003)适量，剪碎，取2g，精密称定，精密加入3％盐酸甲醇50ml，按照“2.1.2”供试品溶液制备操作，分别在0、4、8、12、18、24小时进样，测定血竭素高氯酸盐峰面积，结果见表8。

表8稳定性试验

结果表明，样品中血竭素高氯酸盐峰面积平均值为202170，rsd为1.35％，血竭素含量在24h内符合rsd标准，但在此期间其峰面积也有小幅下降，建议在样品提取后尽快进行检测，保证结果的准确度。

2.6回收率试验

取同一批号(4510003)适量，剪碎，取1g，精密称定，共6份，分别精密加入含有血竭素浓度4.056μg/ml的3％盐酸甲醇混合对照品溶液50ml，按照“2.1.2”供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，测定样品中的血竭素含量，计算回收率，结果见表9。

表9血竭素回收率试验

结果表明，6份样品的回收率均在95％～105％内，血竭素平均回收率为102.3％，rsd为0.72％，均符合药典规定。表明本方法用于测定血竭素含量具有较高的准确度。

2.7样品测定

取10个批号的达仁堂跌打丸样品，分别按照“2.1.2”供试品溶液制备，测定血竭素含量，结果见表10。

表10样品含量测定结果

结果表明，对于不同批次的跌打丸样品，精密加入3％盐酸甲醇50ml对血竭素的含量有很大提高，对跌打丸中血竭素含量提取更加充分。

2.8不同色谱柱对含量测定的影响

取同一批号(4510003)跌打丸样品的供试品溶液，分别采用glinertsil-c185u250*4.6mm色谱柱(见图1、2)，迪马diamonsil-c185u250*4.6mm色谱柱(见图5、6)，phenomenex1c18(2)5u250*4.6mm色谱柱(见图7、8)，用岛津lc-20ad高效液相色谱仪，测定样品中的血竭素含量，结果见表11。

表11不同色谱柱对含量测定的影响

结果表明，采用不同色谱柱对血竭素含量进行测定，色谱峰峰型和分离度良好，测定结果基本不受影响，表明本方法耐用性良好。

2.9含量限度

本品含血竭以血竭素(c17h14o3)计，小蜜丸每1g不得少于0.10mg，大蜜丸每丸不得少于0.30mg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。