分光瞳激光差动共焦CARS显微光谱测试方法及装置与流程

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种分光瞳激光差动共焦cars显微光谱测试方法及装置，可用于快速检测各类样品的微区反斯托克斯散射(cars)光谱，可实现高空间分辨成像与探测。

技术背景

光学显微镜在生物医学领域和材料科学领域被广泛应用，而随着现代科学的快速发展，对显微成像的要求也从结构成像转向功能成像。1990年，共焦拉曼光谱显微技术的成功应用，极大的提高了探索微小物体具体组织成分及形貌的可能。它将共焦显微技术和拉曼光谱技术相结合，具备共焦显微术的高分辨层析成像特征，又兼有无伤检测和光谱分析能力，已成为一种重要的材料结构测量与分析的技术手段，广泛应用于物理、化学、生物医学、材料科学、石油化工、食品、药物、刑侦等领域。

传统的自发拉曼散射成像技术由于拉曼散射本身特性导致其发射信号极弱，即便用高强度的激光激发，要得到一副对比度好的光谱图像，依然需要很长的作用时间。这种长时间作用限制了拉曼显微技术在生物领域的应用。基于相干拉曼效应的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)过程能够很大程度上增强拉曼信号，从而实现快速检测。相干拉曼效应是通过受激激发的光将分子锁定在振动能级上，这种方法产生的振动信号的强度与激发光的强度成非线性关系，可以产生很强的信号，也称为相干非线性拉曼光谱。它具有很强的能量转换效率，曝光时间短，对样品的损害也比较小，同时它的散射具有一定的方向性，容易与杂散光分离。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的产生是一个三阶非线性光学过程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探测光。一般而言，为了减少光源的数量，简化过程，常用泵浦光代替探测光，它们之间的关系如图2所示，当泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的频率之差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，将激发出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的产生过程包含特定的拉曼活性分子的振动模式和导致分子从基态至激发态振动跃迁的入射光场的相互作用过程，它的能级示意图如图3所示。图3(a)表示拉曼共振和非共振单光子增强对cars过程的贡献，图3(b)表示拉曼共振和非共振双光子增强对cars过程的贡献；当wp和ws之间的频差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，激发出的信号得到共振增强；

传统cars显微术大多采用两个单波长激光器，只能获得特定频谱的光谱信息，而且传统cars显微术没有强调系统的定焦能力，导致实际光谱探测位置往往处于离焦位置。即便离焦位置也能激发出样品的拉曼光谱并被针孔后的光谱仪探测，但是强度并不能合理表征该点正确的光谱信号强度。在cars显微系统中，只有当系统精确定焦，才能获得最佳空间分辨力和最好的光谱探测能力。

上述原因限制了cars显微系统探测微区光谱的能力，制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中的应用。基于上述情况，本发明提出将系统收集到的样品表面散射的强于样品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光进行高精度探测，使其与光谱探测系统有机融合，进行空间位置信息和光谱信息的同步探测，以实现高空间分辨的、高光谱分辨的分光瞳激光差动共焦cars图谱成像和探测。

本发明专利的核心思想是选用超连续谱脉冲激光器和单波长脉冲激光器作为激发光源，扩大激发光谱范围，提高光谱激发强度；对接收瑞利光分光瞳激光差动共焦探测系统，利用探测器横向偏移能够使分光瞳共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性，通过对焦斑进行对称分割，对两路信号进行差动处理，实现差动探测。根据差动原理，实现双极性绝对零点跟踪测量，精确定焦，进而实现高空间分辨；精确定焦后，进行光谱探测，获得最佳光谱分辨能力。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提出一种高空间分辨的分光瞳激光差动共焦cars显微光谱测试方法及其装置。

本发明是通过以下技术方案实现的。分光瞳激光差动共焦cars显微光谱测试方法，包括以下步骤：

a)超连续谱激光由超连续谱激光器发出，经过带通滤光片后通过第一二向色镜与单波长激光器发出的单波长激光汇合，通过调整光路使两束光束时序一致、空间重合(单波长激光包络于连续谱激光)；混合光束经过照明光瞳与显微物镜会聚在被测样品上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的cars光；

b)cars光和瑞利光经过第二二向色镜后分成两束，其中包含cars光的光束进入光谱探测单元，另一束包含瑞利光的光束进入分光瞳激光差动共焦探测单元；在光谱探测单元中，包含cars光的光束先经过带通滤光片，滤除光束中的非cars干扰光，然后通过第一会聚镜会聚通过第一针孔，过滤环境光后再由第二会聚镜会聚进入光谱仪,获得cars光谱信息；另一束载有瑞利光的光束通过第三会聚镜后被光强采集系统进行焦斑分割探测，分别得到探测区域a与探测区域b所对应的信号。

c)对a、b两个探测区域的信号进行差动相减处理后，得到差动共焦曲线，利用分光瞳激光差动共焦响应曲线的“过零点”与测量物镜焦点位置精确对应特性，通过“过零点”触发来精确捕获激发光斑焦点位置，实现高空间分辨的几何探测和空间定位。

d)通过计算机处理得到被测样品表面位置(激发光斑焦点)，通过控制高精度三维扫描平移台移动，使激光聚焦在被测样品表面，通过光谱探测单元获取该点的cars光谱信息。

e)单独处理瑞利光的信号，可实现高空间分辨的三维尺度层析成像；单独处理cars光谱信号，可获得光谱图像；同时处理瑞利信号和cars光谱信号，可实现高空间分辨的图谱层析成像，即实现被测样品几何位置信息和光谱信息的图谱合一成像与探测。

特别的，在本发明方法中，照明光瞳和收集光瞳可以是圆形、d形或者其他形状。

特别的，在本发明方法中，激发光束包括线偏光、圆偏光、径向偏振光等偏振光束和由光瞳滤波等技术生成的结构光束，由此提高系统光谱信号信噪比和系统横向分辨率。

特别的，在本发明方法中，通过匹配不同谱带的滤光片，选择不同谱段的斯托克斯光，可以实现不同谱段的光谱探测；其中，带通滤光片与带通滤光片的滤光谱带关于单波长激光器的中心波长对称。

特别的，在本发明方法中，激光发射单元还可以用单波长激光器加光子晶体光纤进行光谱展宽实现，此外，将光谱探测单元中的光谱仪替换成光电点探测器，旋转偏振片可以实现光谱扫描输出，进而激发cars光谱并由光电点探测器探测得到cars光谱信号；

本发明提供了一种分光瞳激光差动共焦cars显微光谱测试装置包括：光谱激发单元、位于光谱激发单元入射方向的激光发射单元、位于光谱激发单元出射方向的二向色单元、位于二向色单元透射方向的光谱探测单元、位于二向色单元反射方向的差动共焦探测单元、控制整个系统的计算机。激光发射单元由单波长脉冲激光器、超连续谱脉冲激光器、带通滤光片和第一二向色镜组成；光谱激发单元由照明光瞳、收集光瞳、测量物镜、待测样品和高精度三维扫描平移台组成；二向色单元即第二二向色镜；光谱探测单元由带通滤光片、第一会聚镜、第一针孔、第二会聚镜和光谱仪组成；激光差动共焦探测单元由第三会聚镜及光强采集系统组成。

在本发明装置中，光强采集系统可以采用双针孔与二象限探测器结合的方法，实现对艾里斑的分割探测。

在本发明装置中，光强采集系统可以采用ccd探测器，通过在ccd探测面设置探测区域的位置及大小，实现对艾里斑的分割探测。

在本发明装置中，光强采集系统可以采用传导光纤，通过在第三会聚镜的焦面上，关于光轴对称放置两根光纤，实现对艾里斑的分割探测。

在本发明装置中，可通过增加中继放大透镜，放大光强采集系统探测到的艾利斑，以提高分光瞳激光差动共焦测量装置的采集精度。

有益效果

本发明方法，对比已有技术具有以下创新点：

1、本发明将分光瞳激光差动共焦显微技术与cars光谱探测技术有机结合，利用分光瞳激光差动共焦曲线“零点”位置与显微物镜焦点位置精确对应的特性，精确捕捉激发光斑焦点位置并探测光谱信息，从而实现高空间分辨的光谱层析成像与探测。

2、本发明中利用二向色镜将瑞利光和载有样品信息的cars光进行分离，其中瑞利光进入分光瞳激光差动共焦探测单元实现几何位置探测，cars光进入光谱探测单元实现cars光谱探测，通过精准定焦捕获激发光斑焦点的光谱信息，提高了系统光谱探测灵敏度。此外，二向色分光装置可以根据需要调整角度，方便结构装调。

3、本发明将分光瞳激光差动共焦显微系统和cars光谱成像系统在结构上和功能上结合，可实现样品微区几何参数的层析成像，又可实现样品微区的光谱探测，还可实现图谱层析成像。

本发明方法，对比已有技术具有以下显著优点：

1、本发明采用的分光瞳激光差动共焦探测方式，利用差动相减噪声相消的特性，抗环境干扰能力强。

2、本发明利用分光瞳激光差动共焦技术对测量聚焦光斑进行高精度定位，并对焦点位置进行实时跟踪测量，消除温度和扰动等环境影响，实现cars谱探测始终精确对应最小激发聚焦光斑区域的样品光谱，大幅提高现有cars显微镜的微区光谱探测能力和几何位置探测能力。

3、本发明采用超连续激光匹配单波长激光作为激发光源，可以实现宽谱带cars光谱探测。

附图说明

图1为摘要附图，即本发明基本实施图；

图2为相干反斯托克斯(cars)光激发原理图；

图3为cars光与泵浦光、斯托克斯光的关系图

图4为传统偏振探测显微光路图；

图5为分光瞳激光差动共焦响应曲线图；

图6为d形分光瞳激光差动共焦cars显微测试方法示意图；

图7为结合光瞳滤波器的分光瞳激光差动共焦cars显微测试方法示意图；

图8为采用双针孔与二象限探测器的分光瞳激光差动共焦cars显微测试方法示意图；

图9为采用ccd探测器的分光瞳激光差动共焦cars显微测试方法示意图；

图10为采用光纤进行探测的分光瞳激光差动共焦cars显微测试方法示意图；

图11为具有探测焦斑放大系统的分光瞳激光差动共焦cars显微测试装置示意图；

图12为单激光器光源的分光瞳激光差动共焦cars显微测试方法示意图；

图13为高空间分辨分光瞳激光差动共焦cars显微测试方法与装置示意图，即实施例用图。

图中，1-激光发射单元、2-单波长激光光源、3-超连续谱激光光源、4-带通滤光片、5-第一二向色镜、6-测量物镜、7-照明光瞳、8-收集光瞳、9-被测样品、10-高精度三维扫描平移台、11-第二二向色镜、12-带通滤光片、13-第一聚光镜、14-第一针孔、15-第二聚光镜、16-光谱仪、17-光谱探测单元、18-分光瞳激光差动共焦探测单元、19-第三聚光镜、20-光强采集系统、21-探测区域a的曲线、22-探测区域b的曲线、23-第一离轴共焦轴向曲线、24-第二离轴共焦轴向曲线、25-差动曲线、26-光瞳滤波器、27-双针孔、28-二象限探测器、29-ccd探测器、30-传导光纤1、31-传导光纤2、32-中继放大透镜、33-偏振分光棱镜、34-偏振片、35-光子晶体光纤、36-第一反射镜、37-光学延时线、38-第二反射镜、39-光电点探测器、40-计算机；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

图1是分光瞳激光差动共焦cars显微光谱探测方法示意图。首先，选用一个单波长脉冲激光器(2)作为泵浦光源和探测光源，由它发出泵浦光(探测光)，然后选用一个频率与之一致的超连续谱脉冲激光器(3)作为斯托克斯光源，在经过带通滤光片(4)后得到要求波长范围内的连续谱激光，通过调节光学结构，使两束激光通过第一二向色镜(5)时间一致，空间重合；混合后的光通过照明光瞳(7)及测量物镜(6)聚焦在被测样品(9)上；由于在紧聚焦的情况下，相位匹配的条件易满足，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的cars光；cars光和瑞利光经第二二向色镜(11)后分别到达光谱探测单元(17)和分光瞳激光差动共焦探测单元(18)；其中，光谱探测单元(17)对cars光进行光谱探测，分光瞳激光差动共焦探测单元(18)对瑞利光进行几何位置探测。

在分光瞳激光差动共焦探测单元(18)中，瑞利光经过第三会聚镜的会聚，被光强采集系统进行分割探测，得到艾里斑第一微区和艾里斑第二微区强度特性曲线，即第一离轴共焦轴向曲线(23)与第二离轴共焦轴向曲线(24)；将第一离轴共焦轴向曲线(23)与第二离轴共焦轴向曲线(24)做相减处理，即得到分光瞳激光差动共焦曲线(25)，即图5。

将圆形照明光瞳(7)和收集光瞳(8)替换为其他形状，如d形，即构成d形分光瞳激光差动共焦cars测试方法，如图6所示。

通过添加光瞳滤波器(26)来提高光谱探测的空间分辨力，即构成添加光瞳滤波器的分光瞳激光差动共焦cars测试方法，如图7所示。

光强采集系统(20)可以采用双针孔(27)与二象限探测器(28)结合的方法，实现对艾里斑的分割探测，如图8所示。

光强采集系统(20)可以采用ccd探测器(29)，通过改变探测焦面上所设置的微小区域的参数以匹配不同的样品的反射率，实现对艾里斑的分割探测，从而可以扩展其应用领域，如图9所示。

光强采集系统可以采用传导光纤，通过在第三会聚镜(19)的焦面处，沿光轴对称放置两根光纤(30、31)，实现对艾里斑的分割探测，如图10所示。

可以在分光瞳激光差动共焦探测系统中增加放大系统(32)，以提高分光瞳激光差动共焦测量装置的采集精度，如图11所示。

图12是单激光器激光差动共焦cars显微测试方法示意图，作用是将激光发射单元的双激光器输入改为单激光器输入，降低成本；单波长脉冲激光器发出单波长激光，经偏振分光棱镜(33)分光，透射部分经过偏振片(34)进入光子晶体光纤(35)进行谱带展宽并用带通滤波片进行特定要求波长截取，反射部分经第一反射镜(36)、光学延时线(37)和第二反射镜(38)后与展宽后的连续谱激光在第一二向色镜(5)处进行耦合，输出空间一致、时间一致的混合光束，对被测样品进行cars光谱激发。其中，光学延时线(37)的作用是保证两束激光时序重合。进一步将光谱探测单元(17)中的光谱仪(16)替换成光电点探测器(39)，旋转偏振片(34)改变光束偏振态使光子晶体光纤(37)输出波长连续变化的谱线作为斯托克斯光，进而实现宽谱带的cars光谱测量。

实施例

在本实施例中，采用波长为532nm的皮秒激光器作为泵浦光源和探测光源，采用重复频率与之一致的超连续谱皮秒激光器添加550～650nmm带通滤光片作为斯托克斯光源，在满足空间重合，时间一致的条件下混合出射，通过光瞳滤波器获得结构光束后，记过照明光瞳及测量物镜紧聚焦在样品上，此时满足相位匹配条件，激发出波长范围在450～515nm的反斯托克斯光(cars)和波长为532nm的瑞利光。

如图13所示,为分光瞳激光差动共焦cars显微光谱测试装置，其测试步骤如下：

首先，在激光发射单元(1)中，超连续谱激光器(3)发出的连续谱激光通过带通滤光片(4)滤光后得到550～650的宽带激光，然后与单波长(532nm)激光器(2)发出单色激光在第一二向色镜(5)处汇合,形成混合光束，其中，这两束激光重复频率一致，到达第一二向色镜(5)时间一致，光束汇合后能够完全重合(泵浦光斑完全包络于斯托克斯光斑)；混合光束经过光瞳滤波器，产生结构光束；结构光束通过照明光瞳与测量物镜紧聚焦在被测样品(9)上，激发出瑞利光和载有被测样品(9)光谱特性的cars光。

此时，对样品扫描可通过以下方式完成：由高精度三维扫描平移台(10)实现x-y-z方向扫描，或在激光出射后的光路中添加振镜扫描结构，实现x-y方向扫描，并通过pzt实现轴向扫描。

被测样品反射回的光束包含斯托克斯光λs、泵浦光λ0、瑞利光λ0、cars光λas；其中，cars光λas和斯托克斯光λs进入光谱探测单元(17)，532nm的泵浦光和瑞利光经第二二向色镜(11)反射进入分光瞳激光差动共焦探测单元(18)。在光谱探测单元(17)中，由斯托克斯光λs和cars光λas混合的光先经过450～515nm的带通滤光片(12)后只保留cars光，然后通过第一会聚镜(13)会聚通过第一针孔(14)，过滤环境光后再由第二会聚镜(15)会聚进入光谱仪(16)，从而探测得到cars光谱i(λ)，其中λ为被测样品(9)受激发光所激发出cars光的波长。在分光瞳激光差动共焦探测单元(18)中，瑞利光λ0通过第三会聚镜会聚，被ccd探测器(29)所接收，通过在ccd探测面上，沿光轴对称设置探测区域的位置及大小，对艾里斑进行分割探测，得到第一离轴共焦轴向曲线(23)与第二离轴共焦轴向曲线(24)。将两路信号做差处理，获得差动信号(25)。分光瞳激光差动共焦响应曲线(25)的“零点”与激发光束的聚焦焦点精确对应，通过响应曲线(25)的“零点”获得被测样品(9)表面的高度信息，结合连接高精度三维扫描平移台(10)的位移传感器反馈的位置信息通过计算机(40)重构出被测样品(9)的表面三维形貌i(x,y,z)。

计算机(40)控制高精度三维扫描平移台(10)，使激光精确聚焦在被测样品(9)表面，激发出能正确表征被测样品光谱特性的cars光谱i(λ)，被光谱探测单元(17)采集，通过计算机(40)将位置信息i(x,y,z)和光谱信息i(λ)融合，完成被测样品(9)的三维重构及光谱信息融合i(x,y,z,r)。此外，计算机系统还贯穿于整个系统，计算机(40)用于实现对高精度三维扫描平移台的位移控制、分光瞳激光差动共焦信号和cars光谱信号的采集处理以及数据融合处理。

以上，沿激光出射方向，依次放置激光发射单元(1)，照明光瞳(7)、显微物镜(6)、被测样品(9)、高精度三维平移台(10)，收集光瞳(8)、第二二向色镜(11)，在第二二向色镜(11)透射方向放置光谱探测单元(17)，在二向色镜(11)反射方向放置分光瞳激光差动共焦探测单元(18)。激光发射单元(1)包括超连续谱激光器(3)、带通滤光片(4)和第一二向色镜(5)以及单波长脉冲激光器(2)；光谱探测单元(17)中依次放置带通滤光片(12)、第一会聚镜(13)、第一针孔(14)、第二会聚镜(15)、光谱仪(16)；在分光瞳激光差动共焦探测单元(18)中，分别放置第三会聚镜(19)与ccd探测器(29)。在整个系统中，单波长脉冲激光器(2)、超连续谱激光器(3)、高精度三维扫描平移台(10)、光谱仪(16)、ccd探测器(29)均受计算机(40)控制，系统得到的三维位置信息和光谱信息也由计算机(40)进行融合处理。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上进行的改动都是本发明的保护范围。