肽癌抗原‑特异性T细胞的受体基因的制作方法

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肽癌抗原‑特异性T细胞的受体基因的制造方法与工艺
本申请是原案申请日为2012年6月20日、原案申请号为201280042412.0(国际申请号为pct/jp2012/065707)、发明名称为“肽癌抗原-特异性t细胞的受体基因”的专利申请的分案申请。技术背景本发明涉及癌抗原特异性t细胞的受体基因中所含的多核苷酸和由该多核苷酸编码的肽,以及使用它们的例如诊断、预后或治疗监测等癌症检查和癌症治疗等。
背景技术
:癌症治疗包括用手术摘除癌症、放射治疗、用抗癌药治疗和免疫疗法。在这些治疗中,免疫疗法在近年来特别引人注意,因为其对癌症更具选择性和特异性且几乎没有副作用。其中,大力进行了通过将大量存在于多种种类的癌细胞和白血病细胞中的wt1蛋白作为靶标来治疗癌症和白血病的探索。为了研究靶向wt1的抗癌治疗的机理并进一步提高治疗效果,有必要鉴定wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)基因的核苷酸序列和由该核苷酸序列编码的受体肽的氨基酸序列。然而,截至目前为止,虽然进行了一些研究(参见例如专利文献1和非专利文献1-5),但对那些受体基因和受体肽的序列及其使用都知之甚少。现有技术文献专利文献专利文献1:wo2008/108257a1非专利文献非专利文献1:valmorid.等人,j.immunol.168:4231-4240,2002非专利文献2:dietrichpy.等人,cancerres.61:2047-2054,2001非专利文献3:couliepg.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.98:10290-10295,2001非专利文献4:godelained.等人.j.immunol.171:4893-4897,2003非专利文献5:mandruzzatos.等人,j.immunol.169:4017-4024,2002。发明概述发明要解决的问题本发明的目的是揭示针对wt1蛋白的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的氨基酸序列以及编码它们的基因的核苷酸序列,特别是其cdr3区的氨基酸序列和核苷酸序列,以及在癌症检查(诊断、预后、治疗监测等)和癌症治疗中使用这些信息。解决问题的手段为了实现上述目的,本发明人进行了广泛的研究并首次确定了健康个体和hla-a*0201阳性患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列,并因而完成了本发明。具体地讲,本发明人首次鉴定了识别wt1癌抗原肽(wt1蛋白的第126-134个氨基酸;rmfpnapyl(seqidno.:1543))的wt1特异性细胞毒性t细胞的t细胞受体(tcr)基因的碱基序列。因此,本发明提供了以下内容:(1)多核苷酸,其具有编码wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列,其中所述多核苷酸具有下述的dna、与该dna互补的rna、或其互补序列,所述dna具有seqidno:1-756所示的任何cdr3核苷酸序列;(2)上述(1)的多核苷酸,其中所述多核苷酸由下述的dna、与其互补的rna、或其互补序列组成,所述dna由seqidno:1-756所示的任何cdr3核苷酸序列组成;(3)肽,其具有wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的氨基酸序列,其中所述肽具有seqidno:757-1512所示的任何cdr3氨基酸序列;(4)上述(3)的肽,其由seqidno:757-1512所示的任何cdr3氨基酸序列组成;(5)(1)或(2)的多核苷酸、或(3)或(4)的肽作为癌标志物的用途;(6)在hla-a*0201-阳性患者中诊断癌症的方法,包括评估在治疗前得自所述患者的样品中的wt1特异性ctl的克隆性(clonality),所述wt1特异性ctl具有(1)或(2)的任何多核苷酸或者(3)或(4)的任何肽,其中在具有多重克隆性的wt1特异性ctl存在的情况下,当具有多重克隆性的wt1特异性ctl的种类更多,或当具有多重克隆性的wt1特异性ctl的克隆性更高时,判定治疗前该患者患癌症的可能性更高;(7)上述(6)的方法,其中当具有任何cdr3多核苷酸或任何cdr3肽且具有3种以上的克隆性的wt1特异性ctl的克隆性更高,或当具有3种以上克隆性的wt1特异性ctl的种类更多时,判定治疗前该患者患癌症的可能性更高;(8)检测hla-a*0201-阳性患者对wt1肽免疫疗法的敏感性的方法,其包括评估在治疗前得自所述患者的样品中的wt1特异性ctl的种类数量和克隆性,所述wt1特异性ctl具有(i)或(2)的任何多核苷酸或者(3)或(4)的任何肽,其中,当所述患者中具有多重克隆性的wt1特异性ctl的种类比对所述免疫疗法无反应的受试者中更多时,判定该患者对wt1肽免疫疗法具有敏感性;(9)上述(8)的方法,其中在治疗前患者中当具有多重克隆性的wt1特异性ctl克隆的种类越多或者克隆性越大时,判定该患者对wt1肽免疫疗法的敏感性越高;(10)在hla-a*2402-阳性患者中监测wt1肽免疫疗法的方法,其包括评估在免疫疗法前后得自所述患者的样品中的wt1特异性ctl克隆的克隆性,所述wt1特异性ctl克隆具有(1)或(2)的任何多核苷酸或者(3)或(4)的任何肽,其中当任何wt1特异性ctl克隆的克隆性在免疫疗法后比免疫疗法前增加时,判定该患者对wt1肽免疫疗法有反应;(11)上述(10)的方法,其中在wt1肽免疫疗法之后,当克隆性的增加率越大、或者具有增加的克隆性的克隆的种类越多时,判定患者对wt1肽免疫疗法的反应性越高;(12)针对上述(3)或(4)的肽的抗体;(13)芯片,其含有(1)或(2)的多核苷酸、(3)或(4)的肽、或者(12)的抗体;(14)cdr3多肽扩增用引物,其具有选自seqidno:1513-1538所示序列的序列;(15)用于诊断癌症的试剂盒、用于检测患者对wt1肽免疫疗法的敏感性的试剂盒、或用于监测wt1肽免疫疗法的试剂盒,所述试剂盒包括用于检测具有(1)或(2)的多核苷酸或者(3)或(4)的肽的wt1特异性ctl的工具(means);(16)用于诊断癌症的装置、用于检测患者对wt1肽免疫疗法的敏感性的装置、或用于监测wt1肽免疫疗法的装置,所述装置包括用于检测具有(1)或(2)的多核苷酸或者(3)或(4)的肽的wt1特异性ctl的工具;(17)上述(15)的试剂盒,其包含(13)的芯片或(14)的引物;(18)上述(16)的装置,其中在所述装置中使用(13)的芯片或(14)的引物;(19)hla-a*0201-阳性癌症患者的淋巴细胞,所述淋巴细胞中引入了含有(1)或(2)的多核苷酸序列的t细胞受体基因。本发明还提供使用来自hla-a*0201-阳性患者的淋巴细胞的癌症治疗,其中将包含cdr3多核苷酸的t细胞受体基因引入到所述淋巴细胞中。此外,本发明还提供针对cdr3多肽的抗体及其用途。发明的效果根据本发明,已经揭示了wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链基因中所含的核苷酸序列以及由其编码的肽的氨基酸序列,具体地讲,揭示了cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列,使用这些多核苷酸和肽,可以进行广泛的癌症检查(诊断、预后、治疗监测等)、有效的癌症治疗等。附图简述[图1-1]图1-1显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图1-2]图1-2显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图1-3]图1-3显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图1-4]图1-4显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图1-5]图1-5显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图1-6]图1-6显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图1-7]图1-7显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图1-8]图1-8显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图1-9]图1-9显示本发明中已鉴定的健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列、其克隆数(克隆性)等。在图中,“克隆#”表示克隆号,点左边的数字表示vβ链的家族号,点右边的数字表示参考编号。“名称”一栏表示克隆所来自的受试者,hd1、hd2、hd3、hd4和hd5分别是指健康个体,而pt1、pt2、pt3、pt4、pt5和pt6是指实体癌患者并且分别是指患有以下癌症的患者:胶质母细胞瘤、原发性神经外胚层瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、盲肠癌和胶质母细胞瘤。v名称、j名称和d名称分别表示v区、j区和d区的细节。核苷酸序列由来源于v区、n1区、d区、(p)n2区或j区的各部分表示。核苷酸序列的右边一栏表示构成核苷酸序列的序列来自哪个区。各核苷酸序列编码的氨基酸序列用本领域技术人员已知的单字母密码表示。氨基酸序列右边两栏是指各健康个体中的克隆性和各癌症患者中的克隆性。最右边一栏是指各克隆的总克隆性。[图2-1]图2-1概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-2]图2-2概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-3]图2-3概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-4]图2-4概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-5]图2-5概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-6]图2-6概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-7]图2-7概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-8]图2-8概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-9]图2-9概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-10]图2-10概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-11]图2-11概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-12]图2-12概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。[图2-13]图2-13概述了得自健康个体和hla-a*0201-阳性实体癌患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列和氨基酸序列。在图中,最左边一栏“名称”是指健康个体或癌症患者,且各符号的含义与图1中的相同。“细胞#”是指得自每个个体的细胞编号。trbv、trbj和trbd分别与图1的v名称、j名称和d名称具有相同含义。在表示核苷酸序列时,点被省略(图1中未省略)。氨基酸序列右边的“*”或“**”是指排列了两个以上的相同序列。实施发明的方式本发明人用由wt1肽/hla-a*0201复合体组成的wt1四聚体对癌症患者的外周血淋巴细胞进行染色,使用facs一一分离wt1四聚体阳性细胞;从分离的各细胞产生cdna,通过应用pcr法确定了编码cdr3的核苷酸序列(图1-1至1-9和图2-1至2-13;seqidno:1-756),所述cdr3包含在wt1特异性细胞毒性t细胞(以下可称为“wt1特异性ctl”)的t细胞受体(以下可称为“tcr”)的vβ链中。根据这些结果,还确定了cdr3的氨基酸序列(图1-1至1-9和图2-1至2-13;seqidno:757-1512)。这些序列是由本发明首次确定的。因此,一方面,本发明提供多核苷酸,该多核苷酸具有编码得自健康个体和hla-a*0201-阳性患者的wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的核苷酸序列,其中该多核苷酸具有有seqidno:1-756所示的任何cdr3核苷酸序列的dna、与该dna互补的rna、或其互补序列。如本文所用,这些dna和rna分子及其互补的多核苷酸统称为“cdr3多核苷酸”。例如,除了包含seqidno:1-756所示的核苷酸序列的dna之外,cdr3多核苷酸还包括含有这些序列的dna。另外,例如,除了与含有seqidno:1-756所示的核苷酸序列的dna互补的rna之外,cdr3多核苷酸还包括含有这些序列的rna。此外,例如,cdr3多核苷酸包括:具有所述dna或rna的序列的多核苷酸、以及与所述rna互补的多核苷酸。“cdr多核苷酸”包括具有编码“cdr3肽”的简并序列的那些。另一方面,本发明提供具有wt1特异性细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)的vβ链的cdr3的氨基酸序列的肽,其中cdr3的氨基酸序列是seqidno:757-1512中任一个所示。如本文所用,这些肽统称为“cdr3肽”。例如,除了含有在seqidno:757-1512所示的任何cdr3氨基酸序列的肽之外,cdr3肽还包括含有这些cdr3氨基酸序列的肽(例如vβ链肽或其一部分)。另外,由在seqidno:757-1512所示的氨基酸序列组成或包含该序列的肽也包括在“cdr3肽”中,该序列中一个或几个(优选1-3个、1个或2个、或1个)氨基酸被取代、添加或缺失seqidno。然而,要求这些肽与原来的肽具有同等功能。这些cdr3肽是由上述cdr3多核苷酸编码的。cdr3区是最多样化的部分,也是与抗原识别的特异性最密切相关的部分。因此,本发明的cdr3多核苷酸序列和cdr3肽序列被认为是hla-a*0201-阳性患者中的wt1特异性ctl特有的。因此,只要编码某t细胞的tcrvβ链基因的cdr3区的多核苷酸或对应于cdr3区的肽具有本发明的多核苷酸或肽的序列,该t细胞就被认为是wt1特异性的。因此,本发明的cdr3多核苷酸和cdr3肽可用作多种多样的癌症的标志物,用于诸如癌症诊断、患者对wt1肽免疫疗法的敏感性的诊断、以及测试患者对wt1肽免疫疗法的反应性。只要是从含有wt1的细胞产生的癌症,本发明的cdr3多核苷酸和cdr3肽就可存在于任何种类的癌症患者的淋巴细胞中。已知wt1是多种癌症和血液系统恶性肿瘤中的癌抗原。因此,本发明的cdr3多核苷酸和cdr3肽以及本发明的如下所述的方法,无论是否是实体癌或是血液系统癌症,都可以适用于几乎所有种类的癌症,例如包括但不限于:诸如急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓细胞白血病、骨髓发育不良综合征和移植同种的造血干细胞后的复发等血液恶性肿瘤;诸如舌癌、牙龈癌、口底癌、咽癌、喉癌、唾液腺癌和甲状腺癌等实体癌症;诸如乳癌、肺癌和胸腺癌等胸部癌症;诸如结肠癌、小肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌、胃肠道内分泌肿瘤和胃肠道类癌等胃肠道癌症;诸如肾癌、尿路上皮癌、生殖细胞瘤、维尔姆斯瘤、前列腺癌、子宫体癌、宫颈癌、子宫肉瘤和卵巢恶性肿瘤等泌尿及生殖道癌;诸如骨原发性恶性肿瘤(例如骨肉瘤和尤因肉瘤)和软组织肉瘤等肌骨骼恶性肿瘤;诸如皮肤癌、神经母细胞瘤、恶性神经胶质瘤(胶质母细胞瘤)、中枢神经系统的原发性恶性淋巴瘤、髓母细胞瘤和pnet等其他癌症。可以使用常规的基因工程技术和/或化学合成工序来制造cdr3多核苷酸或cdr3肽。例如,cdr3多核苷酸可从细胞中分离或经化学合成。cdr3多核苷酸也可以使用诸如pcr等已知的方法来扩增。另外,例如,可以将cdr3多核苷酸(任选使用已知的方法扩增到合适水平)整合至合适的载体中并引入到合适的细胞中,或者可以采用生物射弹轰击或电穿孔而引入到合适的细胞中。然后,对引入了cdr3多核苷酸的细胞进行培养以表达,从而获得cdr3多核苷酸或肽。可用的载体和细胞、基因转移的条件、培养条件以及分离基因和肽的方法是本领域技术人员已知的,可适当选择使用。化学合成可用于制造cdr3多核苷酸或cdr3肽。这类化学合成法是已知的,基因的化学合成法包括使用amidite的固相dna合成以及1-4膦酸酯法;肽的化学合成法包括fmoc法。因此,又一方面,本发明提供诊断hla-a*0201-阳性患者的癌症的方法,该方法包括评估在治疗前得自所述患者的样品中的、具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的克隆性,其中在具有多重克隆性的wt1特异性ctl存在的情况下,当具有多重克隆性的wt1特异性ctl的种类更多,或当具有多重克隆性的wt1特异性ctl的克隆性更高时,判定治疗前该患者患癌症的可能性更高。如本文所用,术语“克隆性”是指检测到具有相同核苷酸序列或者氨基酸序列的细胞的频率。为了考察克隆性,一般使用可以识别单个细胞的细胞分选仪。“患者”包括被怀疑有癌症和患有癌症的人。当进行所述方法时,可将具有多重克隆性的wt1特异性ctl的种类或具有多重克隆性的wt1特异性ctl的克隆性与未患癌症的人进行比较。本发明人发现,通过检查患者中具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的克隆性,可以判定该患者是否患有癌症。从图1-1至1-9和2-1至2-13可知,在健康个体(hd1至hd5)中,具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的克隆性对几乎所有的克隆为1,对少数克隆为2或3,对更少数克隆为4(仅1个克隆);然而,相比之下,在治疗前的所有癌症患者(pt1至pt6)都无一例外地具有多重克隆性,所述克隆性为具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的克隆性。与健康个体相比,其克隆性的数目更大,这样的细胞种类也更多。治疗前患者中的克隆性的增加以及具有多重克隆性的细胞种类的增加,表明了患者体内对癌细胞的防护与攻击已经开始的可能性。鉴于这些结果,如果在检查来自受试者的样品时,在具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl中发现多重克隆性,就可以判定患者有患癌症的可能性。此外,治疗前受试者中的具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的克隆性越大,或者具有多重克隆性的wt1特异性ctl的种类越多,那么可以判定受试者患癌的可能性越高。另外,在上述判定方法中,当治疗前患者中的具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽且具有3种以上的克隆性的wt1特异性ctl的克隆性越大,或者当具有3种以上的克隆性的wt1特异性ctl的种类越多,那么可以判定患者患癌的可能性越高。又一方面,本发明提供用于检测hla-a*0201-阳性患者对wt1肽免疫疗法的敏感性的方法,该方法包括评估在治疗前得自所述患者的样品中的、具有权利要求1的任何多核苷酸或权利要求2的任何肽的wt1特异性ctl的克隆的克隆性和种类数目,其中当该患者中具有多重克隆性的wt1特异性ctl克隆的种类比无反应的受试者中更多时,则该患者被判定为对wt1肽免疫疗法具有敏感性。具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl在患者中起到抵抗癌细胞的作用。在这个过程中,认为治疗前已具有多重克隆性的克隆通过wt1肽免疫疗法可进一步增加克隆性或者保持其克隆性。还认为,当有尽可能多种类的克隆,使得在总体上有效的wt1特异性ctl克隆的数目和种类增加时,wt1免疫疗法更有可能成功。更严格地说,当患者中的具有多重克隆性的wt1特异性ctl克隆的种类比无反应受试者中更多时,可以判定该患者对wt1肽免疫疗法的敏感性高。某一克隆的克隆性的增加显示出wt1肽免疫疗法在一定时期奏效。即使某些克隆的克隆性可能暂时增加而之后下降,其他wt1特异性ctl的克隆性也可增加以补充其效果。考虑到对癌细胞的效果,更希望克隆性有较大的增加。因此,在wt1肽免疫疗法之后,克隆性的增加越大、或具有增加的克隆性的克隆的种类越多,可以认为对wt1肽免疫疗法的反应性高。又一方面,本发明提供用于在hla-a*0201-阳性患者中监测wt1肽免疫疗法的方法,该方法包括评估在治疗前后得自所述患者的样品中的、具有权利要求1的任何多核苷酸或权利要求2的任何肽的wt1特异性ctl克隆的克隆性,其中当任何wt1特异性ctl克隆的克隆性在治疗后比治疗前增加时,则该患者被判定为对wt1肽免疫疗法有反应。由于wt1肽免疫疗法而增加其克隆性的克隆的存在表明对wt1肽免疫疗法的反应性。换句话说,克隆性的增加表明wt1肽免疫疗法在一定时期奏效。这些克隆性的增加可以是暂时性的或持续性的。如果某些克隆的克隆性可能仅暂时增加而之后下降,那么其他wt1特异性ctl的克隆性将增加以补充其效果。考虑到对癌细胞的效果,更希望克隆性有较大的增加。因此,在wt1肽免疫疗法之后,克隆性的增加越大、或具有增加的克隆性的克隆的种类越多,可以判定患者对wt1肽免疫疗法的反应性越高。根据癌症的种类和部位,可使用适当的方法来检查癌细胞的数目及性质。在上述监测治疗的方法中,虽然比较wt1肽免疫疗法前后的克隆性,但治疗前后的时间间隔可以是任何长度。例如,可以是几天、1周、2周、3周、4周、2个月、3个月或更长。在上述本发明的方法中,用于评估克隆性和确定克隆的种类(即确定cdr3肽的氨基酸序列或编码其的核苷酸序列)的工具和方法是本领域已知的,本领域技术人员可以方便地进行这些操作。例如,如本说明书中的实施例所示,可使用facsaria系统等已知的分选装置、以及诸如pcr等基因扩增方法(例如使用选自表1中所列序列的引物组)。为了以更严格或更明确的方式分析本发明的cdr3多核苷酸或cdr肽,人们只需确认在vβ链基因的cdr3的核苷酸序列、imgt、j区和d区是否示于图1-1至1-9和2-1至2-13即可。这种确认是本领域的普通技术。wt1肽免疫疗法也是已知的。例如,可通过对hla-a*0201-阳性患者,经例如透皮途径给予hla-a*0201限制性wt1肽(例如wt1126:氨基酸序列:rmfpnapyl(seqidno:1543)或wt1187:氨基酸序列:slgeqqysv(seqidno:1544))来进行。一般来说,单剂量是μg/kg体重至mg/kg体重的数量级,可以以一周至数周的间隔给药。又一方面,本发明提供含有cdr3多核苷酸或与其互补的多核苷酸的芯片;含有cdr3肽的芯片;或者含有针对cdr3肽的抗体的芯片。这些芯片可以是微芯片、微列阵等形式。这些芯片的生产可以按常规方法进行;例如,可以在玻璃基底上固定针对cdr3多核苷酸或cdr3肽而产生的抗体。固定在芯片上的cdr3多核苷酸或与其互补的多核苷酸、cdr3肽或针对cdr3肽的抗体的种类可以是一种至全部种类;优选将全部种类都固定,以进行全面分析。例如,可以将包含与seqidno:1-756所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的所有种类的多核苷酸都固定在芯片上;备选地,例如,还可以将特异性地识别并结合包含seqidno:757-1512所示的氨基酸序列的所有肽的抗体都固定在芯片上。可将cdr3多核苷酸或与其互补的多核苷酸、cdr3肽、针对cdr3肽的抗体放置在芯片上的任何位置。这些芯片可用于例如上述的癌症诊断。样品可以是患病组织、诸如血液和淋巴液等体液、或黏膜。优选样品是外周血。例如,当分析cdr3多核苷酸时,按常规方法从细胞中提取核酸,使用其上固定了包含与seqidno:1-756所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的所有种类的多核苷酸的芯片,可以检查样品中存在的杂交dna的种类和数量。另外,例如,当分析cdr3肽时,使用其上固定了抗体的芯片,可以检查样品中存在的特异性结合的肽的种类和数量,所述抗体特异性地识别并结合包含seqidno:757-1512所示的氨基酸序列的所有种类肽。在这一点上,本发明提供特异性地识别cdr3肽并与之结合的抗体。优选这类抗体特异性地识别并结合seqidno:757-1512所示的任何氨基酸序列。制备这样的抗体的方法是本领域技术人员已知的。典型地,样品中的dna或置于芯片上的dna序列被标记以指示杂交的有无和杂交量。例如,可以通过将针对seqidno:757-1512的cdr3肽的各抗体在芯片上阵列并测试其与样品中存在的cdr3肽的特异性结合,鉴定样品中的cdr3肽的存在与否或种类。典型地,样品中的肽或芯片上的抗体被标记,使得可以判定特异性结合的存在与否。能够指示杂交或特异性结合的存在与否以及量的标记是已知的,包括例如荧光标记、放射性标记、酶标和发色团标记。本领域技术人员可以方便地选择合适的标记。上述芯片可用于同时分析多个样品。可以使用诸如dna印迹法、rna印迹法、菌落杂交和elisa等已知方法,以及利用上述芯片,分析和鉴定本发明的cdr3多核苷酸和cdr肽。如上所述,使用实施例中所示的引物、特别是表1所示的引物组,已鉴定了本发明的cdr3dna。因此,本发明提供用于扩增cdr多核苷酸的引物,所述引物具有选自seqidno:1513-1538所示序列的序列。例如,含有seqidno:3391-3415所示引物的引物组可用于cdr3核苷酸的扩增。本发明还提供含有用于检测具有cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的工具的、用于诊断癌症的试剂盒;用于测试患者对wt1肽免疫疗法的敏感性的试剂盒;或用于监测wt1肽免疫疗法的试剂盒。本发明还提供含有用于检测具有cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的工具的、用于诊断癌症的装置;用于测试癌症患者对wt1肽免疫疗法的敏感性的装置;或监测wt1肽免疫疗法的装置。诸如上述引物组等用于扩增基因的部分,上述芯片或用于分析得自芯片的信息的工具,可作为构成成分用于试剂盒中,或用于装置中。再一方面,本发明涉及来自hla-a*0201-阳性患者的淋巴细胞,所述淋巴细胞掺入了含有cdr3多核苷酸序列的t细胞受体基因。hla-a*0201-阳性个体包括未患癌症的人和癌症患者。hla-a*0201-阳性个体可以是例如健康个体、骨髓移植供体或癌症患者。优选所述淋巴细胞是外周血淋巴细胞,所述外周血淋巴细胞中引入了含有本发明的cdr3多核苷酸的wt1特异性ctl的tcr的vβ链基因、以及wt1特异性ctl的tcr的vα链基因。在制备这样的外周血淋巴细胞时,wt1特异性ctl的tcr的vβ链的单种基因可用于获得多种外周血淋巴细胞,其继而被引入患者体内。然而,从改善治疗效果的观点考虑,优选使用wt1特异性ctl的tcr的vβ链的多种基因以获取多种外周血淋巴细胞,其继而被引入到患者体内。或者,优选根据个体情况选择待引入的合适基因的核苷酸序列,因为基因中的治疗有效的核苷酸序列可因患者和癌症种类而异。另外,如本文所用,术语癌症的“治疗”不仅包括例如抑制癌症进展、减少癌症、消除癌症等处理,而且也包括预防癌症复发。制备待引入的基因的方法和将基因引入外周血淋巴细胞的方法是本领域已知的。例如,可以将待引入的基因整合到合适的载体中,然后再引入合适的细胞中,或者可以通过生物射弹轰击和电穿孔而引入到合适的细胞中。基因转移和细胞培养的其他条件可由本领域技术人员适当选择。将如上所述已引入基因的淋巴细胞进行离体培养,以获得大量的wt1特异性ctl。然后,可将所得的wt1特异性ctl引入到癌症患者中,以杀灭表达wt1的肿瘤细胞,从而进行癌症治疗。当进行这类癌症治疗时,优选将基因如上所述地引入得自应当进行治疗的癌症患者的外周血淋巴细胞中,并将所得wt1特异性ctl引入同一癌症患者中。可将上述癌症治疗与包括抗癌药物及放射治疗在内的其他癌症治疗联用。上述癌症治疗具有广泛的应用。它们在上文是例示性的,而非限制性的。再一方面,本发明提供针对cdr3肽的抗体及其使用方法。制备这样的抗体的方法是本领域已知的。这样的抗体可以用于检测或鉴定受试者样品中的淋巴细胞,所述淋巴细胞在其vβ链中具有本发明的cdr3肽的氨基酸序列或包含上述序列的氨基酸序列。例如,针对含有seqidno:757-1512的任何氨基酸序列的肽的抗体可用于检测或鉴定癌症特异性淋巴细胞。这些抗体也可用于实施本发明的方法,例如,用于诊断癌症的方法。这种抗体还可以与具有本发明的cdr3氨基酸序列的淋巴细胞接触以激活它们。由此激活的淋巴细胞可用于治疗癌症。优选将得自癌症患者的淋巴细胞激活,必要时,使其增殖,并通过将淋巴细胞返给患者以进行癌症治疗。这样的抗体还可以用于富集目标wt1特异性t细胞。例如,这样的抗体可以用于在癌症患者中富集wt1特异性t细胞,从而辅助癌症治疗。又一方面,本发明提供用于鉴定实体癌症的位置和大小的方法,该方法包括:在用可检测标记作标记之后,给予上述的本发明的外周血淋巴细胞,然后检查所述标记的位置和数量。所述标记可以是已知标记,例如锝-99等放射性标记,以及荧光标记。用于标记细胞的方法也是已知的。标记的检测和信号的定量测定也是本领域已知的;它们可以通过使用辐射计数器、荧光测定、或者通过活组织检查取得组织标本来进行。下文参考实施例,对本发明进行更详细的说明,但应该理解,本发明不视为限于此。实施例1a.实验方法和所用材料(1)细胞样品外周血样品得自5个健康志愿者(hd1至hd5)和6个hla-a*0201-阳性实体癌患者(pt1至pt6)。健康个体和癌症患者的hla等位基因是:hd1:0201/2402,hd2:0201/0206,hd3:0201/2602,hd4:0201/3303,hd5:0201/2402,pt1:0201/2402,pt2:0201/2402,pt3:0201/2402,pt4:0201/2402,pt5:0201/2402,pt6:0201/2402。将所得外周血样品进行ficol1-hypaque(pharmacia,uppsala,瑞典)密度梯度离心,分离外周血单核细胞(pbmc)并冷冻储存在-170°c,直到使用。(2)流式细胞术分析和分选首先,将每一样品2×106pbmc在facs缓冲液(含2%胎牛血清的pbs)中在37℃用pe缀合的hla-a*0201-wt1126-134四聚体(mbl,东京,日本)染色30分钟。然后,在暗处,在冰上,用下述的5种不同荧光染料标记的单克隆抗体对它们染色25分钟:fitc-标记的抗cd4、cd14、cd16、cd19和cd56、抗cd3-percp、抗cd8-apc-cy7(bdbioscience,sanjose,ca)、抗cd45ra-apc和抗ccr7-pe-cy7(bdpharmingen,sandiego,ca)。将染色的细胞用facs缓冲液洗涤两次。使用facsaria系统(bdbiosciences)进行分选,并使用facsdiva软件(bdbiosciences)进行数据分析。结果,从cd4-cd14-cd16-cd19-cd56--细胞的级分中得到单一的hla-a*0201-wt1126-134四聚体+cd3+cd8+细胞,它们被定义为wt1-tet+细胞。(3)从分选的单一细胞合成tcr-β链的cdna在含有反应混合物(反应体积20μl)的pcr管中直接分选如上所述地获得的单一wt1-tet+细胞,通过在50℃孵育90分钟进行cdna合成,然后将样品在95℃孵育5分钟,用于终止反应。rt反应溶液的组成见表1。[表1]成分终浓度rt缓冲液(含tritonx-100)1xcb-rt引物caccagtgtggccttttg(seqidno:1513)200nmdntp0.5mmrna酶抑制剂(invitrogen)0.875u/µlsuperscriptiii(invitrogen)4.5u/µl明胶100µg/mltrna100µg/ml(4)pcr反应将上述程序得到的10μl合成cdna产物加入到40μl反应混合物中,以便进行第一轮pcr反应。pcr程序如下:在95℃9分钟的预pcr加热步骤,然后是40个循环的在95℃45秒的变性步骤,在57℃45秒的退火步骤和在72℃50秒的延伸步骤。第一轮pcr反应液的组成见表2。[表2]成分终浓度pcr缓冲液(不含mg)1xmgcl22mmdntp0.25mmplatinumtaqdna聚合酶(invitrogen)0.02u/µlcb-rt引物(反向)5nmvbpcr-1~3引物混合物(正向)每种引物5nm*vbpcr-1混合物含有s1混合物、s2混合物和s7混合物。vbpcr-2混合物含有s3混合物、s4混合物和s8混合物。vbpcr-3混合物含有s5混合物和s6混合物。然后,上述pcr产物进行第二轮pcr(筛选pcr)。将上述pcr产物分别放入8个单独的管中,将反应混合物加入到每管中。pcr程序如下:在95℃9分钟的预pcr加热步骤,然后是35个循环的在94℃45秒的变性步骤,在57℃45秒的退火步骤,和在72℃40秒的延伸步骤。第二轮pcr反应液的组成见表3。[表3]成分终浓度pcr缓冲液(不含mg)1xmgcl22.5mmdntp0.2mmplatinumtaqdna聚合酶(invitrogen)0.0125u/µl通用cb引物ggaacacgtttttcaggtcct(seqidno:1514)(反向)150nms混合引物(正向)**150nm**将s1混合引物~s8混合引物的每一种加入到8个管的每一个中。各s混合引物含有表4所示的引物。[表4]在表4中,“<>”是指一个核苷酸选自所列举的核苷酸。例如,在显示“....<ct>....”的情况下,是指有两个序列,即“....c....”和“....t....”。为确认在这8个筛选pcr中的阳性反应,对5μl的各筛选pcr产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,接着进行进一步pcr。该pcr通过第3轮pcr反应进行,使用包含在被确认为阳性的s混合引物组中的各vβ-特异性正向引物,并使用如上所述地获得的样品作为模板。pcr程序如下:在95℃9分钟的预pcr加热步骤,接着是35个循环的在94℃45秒的变性步骤,在57℃45秒的退火步骤,和在72℃40秒的延伸步骤。第二轮pcr反应液的组成见表5。将反应产物上样到2%琼脂糖凝胶电泳,以确认阳性反应。按照与上述相同的程序进行实验,使用无细胞体系作为阴性对照。[表5]成分终浓度pcr缓冲液(不含mg)1xmgcl22.5mmdntp0.2mmplatinumtaqdna聚合酶(invitrogen)0.0125u/µl通用cb引物(反向)150nmvb混合引物(正向)***200nm***例如,当使用上述s1混合引物在反应体系中确认了阳性反应时,使用作为s1混合引物的成分的vb1/5、vb11和vb12的每一种,进行第三轮pcr反应。(5)tcr-β的互补决定区3(cdr3)的序列的确定和分析将第三轮pct产物上样到2%琼脂糖凝胶电泳,以确认阳性反应。使用qiaquickpcr纯化试剂盒(qiagen,valencia,ca)纯化tcr-β基因的扩增片段。相应的vb引物用于测序。abipriambigdyeterminatorv3.1cyclesequencing试剂盒(appliedbiosystems,fostercity,ca,usa)用于测序,abiprism3100geneticanalyzer(appliedbiosystems)用于分析。通过将其序列与从imgt人tcr基因数据库网站得到的那些进行比较,对cdr3的序列数据进行分析。b.结果在本发明中,可测定来自5个hla-a*0201-阳性健康个体(hd1至hd5)和6个hla-a*0201-阳性癌症患者(pt1至pt6)的外周血单核细胞中的tcrβ链的636个基因的碱基序列,并且可测定所述基因编码的氨基酸序列。得自健康个体(hd1至hd5)和癌症患者(pt1至pt6)的wt1特异性ctl的vβ链基因的序列、j区序列、d区序列、n区序列、cdr3核苷酸序列和cdr3氨基酸序列见图1-1至1-9。每个个体的wt1特异性ctl的克隆性见图2-1至2-13。cdr3核苷酸序列示于seqidno:1-636,cdr3氨基酸序列示于seqidno:757-1392。另外,按照上述程序,测定了来自1个hla-a*0201-阳性的甲状腺癌患者(pt7)和1个hla-a*0201-阳性健康个体(hd6)的外周血样品的cdr3核苷酸序列和cdr3氨基酸序列。得自pt7和hd6的cdr3核苷酸序列示于seqidno:637-756,得自pt7和hd6的cdr3氨基酸序列示于seqidno:1393-1512。从图2-1至2-13可见,在健康个体(hd1至hd5)中,具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的克隆性,对几乎所有的克隆为1,对于少数克隆为2或3,对于更少数的克隆为4(仅1个克隆);然而,在治疗前的所有癌症患者(aml和mds)都无一例外地具有多重克隆性,所述克隆性为具有任何cdr3多核苷酸或cdr3肽的wt1特异性ctl的克隆性。与健康者相比,在癌症患者中的克隆性的数目倾向于更大,这样的细胞种类倾向于更多。具体地讲,pt1:4种(总体的克隆性为30);pt2:10种(总体的克隆性为38);pt3:8种(总体的克隆性为26);pt4:4种(总体的克隆性为9);pt5:9种(总体的克隆性为20);和pt6:5种(总体的克隆性为13)。另一方面,在健康个体hd1至hd5中,在各个体中具有多重克隆性的克隆种类是1至5种,总体的克隆性是2至10。在上文中,对于hla-a等位基因是a*0201的情况,描述了本发明;然而,本申请可适用于hla-a等位基因是a*0206的情况。工业适用性本发明提供可用于抗癌治疗的药物组合物,癌症检查试剂盒或试剂,用于癌症研究的试剂等。因此,本发明可用于癌症治疗用药物、癌症检查试剂盒或试剂、以及癌症研究等领域。<110>internationalinstituteofcancerimmunology,inc.<120>肽癌抗原-特异性t细胞的受体基因<130>670952<150>jp2011-143273<151>2011-06-28<160>1544<170>patentin版本3.2<210>1<211>45<212>dna<213>人(homosapiens)<400>1tgtgccagcaaaccagggaccacccggaacaatgagcagttcttc45<210>2<211>33<212>dna<213>人<400>2tgtgccagcatggatgggtctgagcagttcttc33<210>3<211>45<212>dna<213>人<400>3tgtgcctccccccccctcaacaggggcgaaaatgagcagttcttc45<210>4<211>48<212>dna<213>人<400>4tgtgccagccaaaacttagcgggccctcagtacaatgagcagttcttc48<210>5<211>36<212>dna<213>人<400>5tgtgccagcagagatcggagaaacaccatatatttt36<210>6<211>36<212>dna<213>人<400>6tgtgccagcaggggggagggattagaagctttcttt36<210>7<211>42<212>dna<213>人<400>7tgtgccagcagaggtcaacagaatttctatggctacaccttc42<210>8<211>45<212>dna<213>人<400>8tgtgccagcagtgcgggacaggtttttcccggggagctgtttttt45<210>9<211>42<212>dna<213>人<400>9tgtgccagcagtgcaagactcaatgtggagacccagtacttc42<210>10<211>45<212>dna<213>人<400>10tgtgccagcagtgacgccgcggctaccaattacgagcagtacttc45<210>11<211>45<212>dna<213>人<400>11tgtgccagcagtgatggagggggggcgcaagagacccagtacttc45<210>12<211>45<212>dna<213>人<400>12tgtgccagcagtgacggcgggggggcgagtgagacccagtacttc45<210>13<211>48<212>dna<213>人<400>13tgtgccagcagtgaagcgcattgggacaggcaagagacccagtacttc48<210>14<211>45<212>dna<213>人<400>14tgtgccagcagtgaagcgcttatgacattctacgagcagtacttc45<210>15<211>48<212>dna<213>人<400>15tgtgccagcagtgaagatcggcagaggacggatgagacccagtacttc48<210>16<211>45<212>dna<213>人<400>16tgtgccagcagtgaagggggcggggctcaagagacccagtacttc45<210>17<211>45<212>dna<213>人<400>17tgtgccagcagtgaaggcggtggggggcaggagacccagtacttc45<210>18<211>45<212>dna<213>人<400>18tgtgccagcagtgagggggggggcctcgccgagacccagtacttc45<210>19<211>45<212>dna<213>人<400>19tgtgccagcagtgagggacatccaagtcaatacgagcagtacttc45<210>20<211>45<212>dna<213>人<400>20tgtgccagcagtgaaacagggtctagcacagatacgcagtatttt45<210>21<211>42<212>dna<213>人<400>21tgtgccagcagtgaatggcaagggaattcacccctccacttt42<210>22<211>45<212>dna<213>人<400>22tgtgccagcagtgaatggacaggggataccggggagctgtttttt45<210>23<211>42<212>dna<213>人<400>23tgtgccagcagcattgggaccttgaacactgaagctttcttt42<210>24<211>36<212>dna<213>人<400>24tgtgccagcagcctcgtaggagaggtgtcactcttc36<210>25<211>39<212>dna<213>人<400>25tgtgccagcagcccgggggtaagtcagccccagcatttt39<210>26<211>39<212>dna<213>人<400>26tgtgccagcagtacgggacttcgagaaaaactgtttttt39<210>27<211>51<212>dna<213>人<400>27tgtgccagcagtgttccagacgggacagggggcgacaatggctacaccttc51<210>28<211>45<212>dna<213>人<400>28tgtgccagcagttgggtaggggactaccaagagacccagtacttc45<210>29<211>42<212>dna<213>人<400>29tgtgccaccgggactagcgggtaccgggagacccagtacttc42<210>30<211>45<212>dna<213>人<400>30tgtgccaccggttggggagattctagcacagatacgcagtatttt45<210>31<211>51<212>dna<213>人<400>31tgtgccacgcacgaggctagcgggaaatggggccaggagacccagtacttc51<210>32<211>43<212>dna<213>人<400>32tgacctgaatgaaacgttccgccggccctacgagcagtacttc43<210>33<211>39<212>dna<213>人<400>33tgtgccagccgctccttagcggggggtgagcagttcttc39<210>34<211>42<212>dna<213>人<400>34tgtgccagcagcggacgaccgggtggtgaaaaactgtttttt42<210>35<211>51<212>dna<213>人<400>35tgtgccagcagcctcgccctagcgggagggatctcctacgagcagtacttc51<210>36<211>45<212>dna<213>人<400>36tgtgccagcagcctagacagtgcctcctacaatgagcagttcttc45<210>37<211>48<212>dna<213>人<400>37tgtgccagcagcccgtttcggggggagattgtagagacccagtacttc48<210>38<211>42<212>dna<213>人<400>38tgtgccagcagcccgatagataaacccggggagctgtttttt42<210>39<211>42<212>dna<213>人<400>39tgcgccagcagcccaccccccggaggggaaaaactgtttttt42<210>40<211>45<212>dna<213>人<400>40tgtgccagcagcccgcgagcgggggcgggcggggagctgtttttt45<210>41<211>45<212>dna<213>人<400>41tgtgccagcagccaagaactttcccccccttacgagcagtacttc45<210>42<211>48<212>dna<213>人<400>42tgtgccagcagccaactcgaccggacgaacaccggggagctgtttttt48<210>43<211>48<212>dna<213>人<400>43tgtgccagcagccaactcgaaaccacccgtaagggaaaattgtttttt48<210>44<211>39<212>dna<213>人<400>44tgtgccagcagccaattaggggattttggctacaccttc39<210>45<211>54<212>dna<213>人<400>45tgtgccagcagccagagttcactagcgggagggccgagcggggagctgtttttt54<210>46<211>51<212>dna<213>人<400>46tgtgccagcagccaaaccgggtcacctcaaatcacagatacgca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