一种鉴别革兰氏阳性细菌和阴性细菌的指示材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种鉴别革兰氏细菌的指示材料和鉴别革兰氏细菌的方法，属于医学检验、菌属鉴别技术领域。

背景技术：

细菌细胞既微小又透明，一般先要染色才能通过显微镜观察进行鉴别。各种染色法中，丹麦医生c.gram1884年发明的革兰氏染色法是最重要、最广泛使用的一种染色法。革兰氏染色法首先将各种细菌用结晶紫初染，再用媒染剂碘液处理、酒精脱色，最后用番红等红色染料复染。通过染色能将细菌区分成两类：紫色的革兰氏阳性细菌(grampositivebacterium,g⁺)；红色的革兰氏阴性细菌(gramnegativebacterium,g^-)。染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。经结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌的细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫-碘复合物，革兰氏阳性菌由于细胞壁较厚、肽聚糖网层次多且交联致密，当用乙醇或丙酮脱色处理时，细胞壁因失水使网孔缩小，加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌的细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫-碘复合物的溶出，因此经乙醇脱色后仍呈无色，再经红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小细菌的鉴定范围，有利于进一步分离鉴定细菌，从而对细菌引起的疾病做出诊断。由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色法也是选用抗生素的重要参考。

革兰氏染色法应用广泛，但要使用染料反复染色，并依赖显微镜人工观察来鉴别细菌种类，操作繁琐，鉴别时间长，不能满足快速细菌鉴别的要求。各种改进和新的革兰氏阴阳性细菌鉴别的方法已有报道。中国专利公开号cn101636415b，2015年，马丁纳·贝辛格，斯蒂芬·米勒，安贾·菲利普，迈克尔·许茨，用于富集、除去和检测革兰氏阳性细菌的方法和手段，公开了一种用多肽特异性结合革兰氏阳性菌，检测革兰氏阳性菌的方法；中国专利公开号cn102080121a，2011年，爱德华·鲁伊兹·雷森迪·德卡斯特罗，细菌学中使用的染色方法和装置，公开了一种能使传统的革兰氏染色法标准化的方法和装置；中国专利公开号cn1687459，2005年，张治位，祝令香，王璨，杨卫华，张琼，程京，革兰氏阳性细菌种属鉴定与耐药性基因检测方法及其专用试剂盒，公开了一种扩增待测革兰氏阳性细菌菌株的种属特异性及耐药性基因的引物对和检测探针；

利用多孔二氧化硅纳米颗粒识别革兰氏阳性细菌(acsappliedmaterialsinterfaces,2013,5,10874-10881)；利用磁性荧光纳米粒子识别革兰氏阳性细菌(acsnano,2011,5,8834-8841)；利用荧光金纳米簇识别革兰氏阳性细菌(analyticalchemistry,2016,88,820-825)以及利用碳量子点识别革兰氏阳性细菌(biosensorsandbioelectronics,2015,74,546-553)也有报道。现有的技术虽然对传统的染色鉴定法有许多改进，仍然需要较长的鉴定时间和各种各样的仪器设备，对细菌的鉴别有待于开发更快速、简便的方法。

技术实现要素：

发明目的：本发明要解决的第一个技术问题是提供一种鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的指示材料，这种指示材料能快速简便地鉴别革兰氏阳性/阴性细菌。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌指示材料的制备方法。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种革兰氏阴阳性细菌指示材料在鉴别革兰氏阳性/阴性细菌方面的应用。

技术方案：为解决上述第一个技术问题，本发明提供一种鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的指示材料，利用万古霉素和聚乙二醇作为金纳米粒子的保护剂，获得万古霉素和聚乙二醇修饰的金纳米粒子，用万古霉素和聚乙二醇修饰的金纳米粒子作为鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的指示材料。这种指示材料利用金纳米粒子上的万古霉素选择性地结合革兰氏阳性细菌的细胞壁而不结合革兰氏阴性细菌，使革兰氏阳性细菌显红色，使革兰氏阴性细菌不显色，从而鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。这种指示材料因为修饰了聚乙二醇特别稳定，有长的使用寿命。

为解决上述第二个技术问题，本发明提供一种鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌指示材料的制备方法，包括如下具体步骤：

步骤1：向一定浓度的氯金酸水溶液中加入一定量的万古霉素水溶液，构成万古霉素：氯金酸的摩尔比为0.5～20:1的混合液；

步骤2：加入适量氢氧化钠溶液将上述混合液的ph值调至弱碱性，在室温搅拌下反应4小时，加入少量聚乙二醇，搅拌下反应1小时，离心收集沉淀，用超纯水洗涤沉淀后离心分离，沉淀重悬于超纯水中备用。

其中，上述混合液的ph值调至碱性，碱性的ph范围为10-14。

其中，上述聚乙二醇为一端修饰巯基的聚乙二醇，分子量为100-200。

为解决上述第三个技术问题，本发明提供一种鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌指示材料的应用，所述的鉴别革兰氏细菌方面的应用具体是通过目视比色法鉴定革兰氏阳性/阴性细菌，目视比色鉴定是通过万古霉素修饰的金纳米粒子的红色结合银染色法形成黑色实现的，具体步骤如下：将含有一定量未知种类的革兰氏阳性菌/阴性菌的溶液通过离心分离的方法洗涤后，与鉴别革兰氏阳性细菌和阴性细菌的指示材料的悬浮液充分混合，室温下反应30～60分钟，将少量反应后的混合液滴在膜上形成斑点，待膜上斑点晾干后，斑点显红色的是革兰氏阳性细菌，不显色的是革兰氏阴性细菌；或在这些斑点上继续滴加银染试剂，1分钟后，将膜置于硫代硫酸钠溶液中漂洗60秒钟，斑点显黑色的是革兰氏阳性细菌，不显色的是革兰氏阴性细菌。

其中，上述的膜是醋酸纤维素膜或组成为纤维素的滤纸。

其中，上述的银染试剂由氢醌、硝酸银和柠檬酸盐或醋酸盐构成。

有益效果：与已报道的革兰氏细菌染色鉴定方法或装置相比，本发明具有如下特色及优点：1)本发明的革兰氏阳性/阴性细菌的指示材料由于使用了巯基聚乙二醇稳定金纳米粒子，稳定、使用寿命长且无毒，无须使用容易引起畸变的有机染料；2)本发明的制备方法简便。常温制备，制备时间短，对操作者的实验技术几乎没有要求，无须通常制备方法中长的反应时间和加热或高温反应；3)本发明的细菌鉴定方法是一种快速的目视比色鉴定法。无须常规的染料反复染色、洗脱、加热、显微镜观察等繁琐步骤，无须借助显微镜放大设备；克服了传统染色鉴定法时间长的不足，有利于对细菌引起的疾病快速诊断，适合野外或缺乏设备的场合使用。本发明将在生物医学检验、菌属鉴别、食品安全、环境监测等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1.鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的透射电镜图；

图2.鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料溶液的紫外吸收谱图和颜色照片；

图3.鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料溶液与革兰氏阳性细菌混合后的紫外吸收谱图；

图4.革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附效果图；

图5.革兰氏阴性细菌大肠杆菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附效果图；

图6.革兰氏阳性细菌藤黄微球菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附效果图；

图7.革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附效果图；

图8.鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的制备

向5ml浓度为2mm的万古霉素水溶液中加入5ml浓度为1mm的氯金酸水溶液，搅拌充分混合后，在混合液中加入0.1ml浓度为10mm的氢氧化钠水溶液使混合液的ph值为14，室温搅拌下反应4小时，按400:1(v/v)加入100mg/ml含巯基的聚乙二醇(分子量为100)，搅拌下反应1小时，将反应液离心分离得到金纳米粒子，用超纯水洗涤金纳米粒子1次，将金纳米粒子重悬于超纯水中得到鲜红色的金纳米粒子溶胶即为鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料，4℃保存备用。图1是万古霉素修饰的金纳米粒子的透射电镜图，万古霉素修饰的金纳米粒子具有球状外形。图2是万古霉素修饰的金纳米粒子溶液的紫外吸收谱图和颜色照片，万古霉素修饰的金纳米粒子溶液呈鲜红色，在520nm有最大吸收峰。

实施例2鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的制备

向5ml浓度为10mm的万古霉素水溶液中加入5ml浓度为1mm的氯金酸水溶液，搅拌充分混合后，在混合液中加入0.1ml浓度为10mm的氢氧化钠水溶液使混合液的ph值为10，室温搅拌下反应4小时，按400:1(v/v)加入100mg/ml含巯基的聚乙二醇(分子量为200)，搅拌下反应1小时，将反应液离心分离得到金纳米粒子，用超纯水洗涤金纳米粒子1次，将金纳米粒子重悬于超纯水中得到鲜红色的金纳米粒子溶胶即为鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料，4℃保存备用。

实施例3鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的制备

向5ml浓度为5mm的万古霉素水溶液中加入5ml浓度为5mm的氯金酸水溶液，搅拌充分混合后，在混合液中加入0.1ml浓度为10mm的氢氧化钠水溶液使混合液的ph值为13，室温搅拌下反应4小时，按400:1(v/v)加入100mg/ml含巯基的聚乙二醇(分子量为100)，搅拌下反应1小时，将反应液离心分离得到金纳米粒子，用超纯水洗涤金纳米粒子1次，将金纳米粒子重悬于超纯水中得到鲜红色的金纳米粒子溶胶即为鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料，4℃保存备用。

实施例4鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的制备

向5ml浓度为20mm的万古霉素水溶液中加入5ml浓度为1mm的氯金酸水溶液，搅拌充分混合后，在混合液中加入0.1ml浓度为10mm的氢氧化钠水溶液使混合液的ph值为12，室温搅拌下反应4小时，按400:1(v/v)加入100mg/ml含巯基的聚乙二醇(分子量为200)，搅拌下反应1小时，将反应液离心分离得到金纳米粒子，用超纯水洗涤金纳米粒子1次，将金纳米粒子重悬于超纯水中得到鲜红色的金纳米粒子溶胶即为鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料，4℃保存备用。

实施例5鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的制备

向5ml浓度为2.5mm的万古霉素水溶液中加入5ml浓度为5mm的氯金酸水溶液，搅拌充分混合后，在混合液中加入0.1ml浓度为10mm的氢氧化钠水溶液使混合液的ph值为13，室温搅拌下反应4小时，按400:1(v/v)加入100mg/ml含巯基的聚乙二醇(分子量为100)，搅拌下反应1小时，将反应液离心分离得到金纳米粒子，用超纯水洗涤金纳米粒子1次，将金纳米粒子重悬于超纯水中得到鲜红色的金纳米粒子溶胶即为鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料，4℃保存备用。

实施例6鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料对革兰氏阳性细菌/阴性细菌的选择性

将一定量革兰氏阳性细菌代表金黄色葡萄球菌或革兰氏阴性细菌代表大肠杆菌的菌液通过离心分离的方法洗涤3次，用流式细胞仪定量菌液的浓度。将浓度为8×10⁸，6×10⁸，4×10⁸，3×10⁸，2×10⁸，1×10⁸，0.5×10⁸，0×10⁸细胞/ml的菌液0.5ml分别与0.5ml上述实施例1制备得到的鉴别革兰氏阳性细菌和阴性细菌的指示材料(0.2mg/ml)混合，室温下反应30分钟，离心分离上清液测定吸光度。

图3是鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料与金黄色葡萄球菌作用后的紫外吸收谱图，鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料与金黄色葡萄球菌混合后，离心分离得到的上清液在520nm处的吸光度随金黄色葡萄球菌浓度的增加而下降说明上清液中的鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的浓度随金黄色葡萄球菌浓度的增加而下降，金黄色葡萄球菌浓度愈高吸附的鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的量愈大。

图4是金黄色葡萄球菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附效果图，用a0表示鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料溶液的吸光度，a表示鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料与不同浓度的黄色葡萄球菌混合后离心分离上清液的吸光度，金黄色葡萄球菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附量与金黄色葡萄球菌菌体浓度呈线性正比关系。

图5是革兰氏阴性细菌大肠杆菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附效果图，大肠杆菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料几乎不结合。

图6是革兰氏阳性细菌藤黄微球菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附效果图，革兰氏阳性细菌藤黄微球菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附量与其浓度呈线性正比关系。

图7是革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附效果图，革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附量与其浓度呈线性正比关系。

从图4、图6、图7可看出，同样量的不同革兰氏阳性细菌对鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料的吸附量不同。

实施例7鉴定革兰氏阳性细菌和阴性细菌的指示材料目视比色法鉴别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌

将一定量的革兰氏阳性细菌代表金黄色葡萄球菌或革兰氏阴性细菌代表大肠杆菌的菌液离心分离洗涤3次，用流式细胞仪定量菌液的浓度。浓度为80×10⁹，40×10⁹，20×10⁹，10×10⁹，5×10⁹，2×10⁹，1×10⁹细胞/ml的菌液0.5ml分别与0.5ml上述实施例1制备的鉴别革兰氏阳性细菌和阴性细菌的指示材料(0.2mg/ml)混合，室温下反应30分钟，离心分离出沉淀，再分别加1ml无菌水形成均匀的悬浮液，将2μl这些悬浮液分别滴在醋酸纤维素膜上形成斑点，待膜上斑点晾干后，斑点显红色的是革兰氏阳性细菌，不显色的是革兰氏阴性细菌。或在这些斑点上继续滴加2μl银染试剂，1分钟后，将膜置于2.5％硫代硫酸钠溶液中漂洗60秒钟，斑点显黑色的是革兰氏阳性细菌，不显色的是革兰氏阴性细菌。该银染试剂为氢醌、硝酸银和柠檬酸盐。

图8是鉴定革兰氏阳性细菌和阴性细菌的指示材料鉴别革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(上面一排)和革兰氏阴性细菌大肠杆菌(下面一排)经银染的斑点图，细菌菌体浓度从左向右分别为8×10¹⁰菌体/ml，4×10¹⁰菌体/ml，2×10¹⁰菌体/ml，1×10¹⁰菌体/ml，5×10⁹菌体/ml，2×10⁹菌体/ml，1×10⁹菌体/ml，目视比色法鉴别金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的灵敏度约为5×10⁹菌体/ml。

实施例2～5制备得到的鉴别革兰氏阳性/阴性细菌指示材料均获得了与实施例6和7相同及相似的结果。