本发明涉及一种检测用质控品及其配制方法，特别涉及氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品及其制备方法。
背景技术：
遗传代谢病是指由于基因突变使合成的酶、受体、载体等蛋白功能缺陷，导致体内生化物质在合成、代谢、转运和储存等方面出现各种异常。它属于单基因遗传病的一部分，绝大多数属常染色体隐性遗传，少数为常染色体显性遗传、x连锁伴性遗传，或者线粒体遗传；遗传代谢病病种繁多，常见500-600种，总数可能达数千余种；单病发病率低，但总体发病率较高，有报道患病率在0.5％以上。
新生儿疾病筛查是预防出生缺陷行之有效的三级预防措施，对提高出生人口素质有着重要的意义。串联质谱检测的遗传代谢病项目在2分钟内可检测18种氨基酸和45种酰基肉碱，上述遗传代谢病可检测超过45种遗传代谢病，目前已广泛应用于各种高端实验室，可更有效、更早地检出遗传性代谢性疾病，为针对性治疗提供有效依据。随着该技术越来越多地应用于临床的辅助诊断，体内氨基酸和酰基肉碱测定的准确性显得越来越重要。
质控品是专门用于室内质量控制的、稳定的、与待测样品近似的材料，是保证准确测定的重要基础，并可对方法稳定性进行一个长期有效的监控，随着串联质谱检测越来越多地应用于临床的辅助诊断，相关质控品的需求量也逐渐增大。
由于串联质谱一次检测的化合物种类繁多，一般而言，为保证其质控效果，其质控品中也需要添加多种组分，而因为各组分的特性不同，难以制备得到均一稳定的质控品。因此，目前，商品化氨基酸和酰基肉碱干血斑质控品来源少，且产品价格昂贵，到货周期长，同一批号无稳定性来源。因此，研发稳定性、均一性都符合要求的质控品制备方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种成份相对简单、稳定性、均一性均符合要求的氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品，主要由氨基酸标准品、酰基肉碱标准品和红细胞干固于载体上形成，其中，氨基酸标准品包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、精氨酸、酪氨酸共8种氨基酸。
作为上述氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的进一步改进，酰基肉碱标准品包括游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、葵酰肉碱、月桂酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱、棕榈酰肉碱、十八碳酰肉碱、3-羟基异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、丙二酰肉碱共15种酰基肉碱。
作为上述氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的进一步改进，质控品中各氨基酸按照以下述终摩尔比配合：
作为上述氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的进一步改进，质控品中各酰基肉碱按下述终摩尔比配合：
作为上述氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的进一步改进，载体为滤纸。滤纸可以是国际903滤纸片等本领域常用的滤纸。
一种上述的氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的制备方法，包括如下步骤：
1)制备红细胞液：收集健康人源全血，分离得到红细胞，用生理盐水调整红细胞比容至预定值，得到红细胞液，并测定其中各氨基酸和酰基肉碱本底值；
2)制备标准溶液：使用水性溶剂将氨基酸和/或水溶性酰基肉碱溶解；使用醇类溶剂溶解脂溶性酰基肉碱，得到氨基酸标准溶液和/或酰基肉碱标准溶液；
3)制备血斑质控品：在上述红细胞液中添加氨基酸标准溶液和/或酰基肉碱标准溶液至设定值，得到工作液；取上述工作液滴加在载体上，干燥得到氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品。
作为上述制备方法的进一步改进，水性溶剂为生理盐水，所述氨基酸为：丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸；所述水溶性酰基肉碱为：游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、葵酰肉碱、3-羟基异戊酰肉碱、戊二酰肉碱和丙二酰肉碱；醇类溶剂为甲醇，所述脂溶性酰基肉碱为：月桂酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱、棕榈酰肉碱、十八碳酰肉碱。
作为上述制备方法的进一步改进，制备红细胞液步骤中，红细胞比容的预定值为45～55％。
作为上述制备方法的进一步改进，工作液中，各氨基酸的浓度分别为：丙氨酸350～650μm、苯丙氨酸120～300μm、亮氨酸150～450μm、甲硫氨酸50～170μm、缬氨酸200～400μm、瓜氨酸40～150μm、精氨酸60～200μm、酪氨酸180～370μm；各酰基肉碱的浓度分别为：游离肉碱30～70μm、乙酰肉碱20～40μm、丙酰肉碱5～12μm、丁酰肉碱1～3.5μm、异戊酰肉碱0.5～2.0μm、己酰肉碱0.4～1.2μm、辛酰肉碱0.4～1.2μm、葵酰肉碱0.4～1.2μm、月桂酰肉碱0.3～1.0μm、肉豆蔻酰肉碱0.4～1.4μm、棕榈酰肉碱4.0～12.0μm、十八碳酰肉碱1.5～6.0μm、3-羟基异戊酰肉碱0.4～1.2μm、戊二酰肉碱1.0～3.0μm、丙二酰肉碱0.2～1.0μm。
作为上述制备方法的进一步改进，制备血斑质控品步骤中，取70～100μl工作液滴加在载体上。
本发明的有益效果是：
本发明的氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品，通过精心设计组份，综合考虑检测方法的特点和18种氨基酸与45种酰基肉碱检测指标的重要性之后选出，最具代表性，在大幅减少标准品使用的情况下，获得了稳定性、均一性都符合要求的氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品。
并且，该质控指标的浓度也是非常关键的，同样是综合考虑检测方法的特点和各检测指标的特点之后选出，具有最佳的代表性和稳定性。
该质控品制备方法成本低，操作简单，能够较大量的进行配制，使用周期较长，不需频繁更换质控批号，方便日常质控分析，从而满足临床和日常检测对质控品的需求。
采用本发明提供的制备方法制得的氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品在-20℃的条件下可保存4个月以上，从-20℃条件取出恢复常温后的均一性、稳定性都能符合质控品要求。
具体实施方式
一种氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品，主要由氨基酸标准品、酰基肉碱标准品和红细胞干固于载体上形成，其中，氨基酸标准品包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、精氨酸、酪氨酸共8种氨基酸。
作为上述氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的进一步改进，酰基肉碱标准品包括游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、葵酰肉碱、月桂酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱、棕榈酰肉碱、十八碳酰肉碱、3-羟基异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、丙二酰肉碱共15种酰基肉碱。
作为上述氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的进一步改进，质控品中各氨基酸按照以下述终摩尔比配合：
作为上述氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的进一步改进，质控品中各酰基肉碱按下述终摩尔比配合：
作为上述氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的进一步改进，载体为滤纸。滤纸可以是国际903滤纸片等本领域常用的滤纸。
一种上述的氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品的制备方法，包括如下步骤：
1)制备红细胞液：收集健康人源全血，分离得到红细胞，用生理盐水调整红细胞比容至预定值，得到红细胞液，并测定其中各氨基酸和酰基肉碱本底值；
2)制备标准溶液：使用水性溶剂将氨基酸和/或水溶性酰基肉碱溶解；使用醇类溶剂溶解脂溶性酰基肉碱，得到氨基酸标准溶液和/或酰基肉碱标准溶液；
3)制备血斑质控品：在上述红细胞液中添加氨基酸标准溶液和/或酰基肉碱标准溶液至设定值，得到工作液；取上述工作液滴加在载体上，干燥得到氨基酸与酰基肉碱干血斑质控品。
作为上述制备方法的进一步改进，水性溶剂为生理盐水，所述氨基酸为：丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸；所述水溶性酰基肉碱为：游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、葵酰肉碱、3-羟基异戊酰肉碱、戊二酰肉碱和丙二酰肉碱；醇类溶剂为甲醇，所述脂溶性酰基肉碱为：月桂酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱、棕榈酰肉碱、十八碳酰肉碱。
醇类溶剂也包括醇的水溶液。
作为上述制备方法的进一步改进，制备红细胞液步骤中，红细胞比容的预定值为45～55％。
作为上述制备方法的进一步改进，工作液中，各氨基酸的浓度分别为：丙氨酸350～650μm、苯丙氨酸120～300μm、亮氨酸150～450μm、甲硫氨酸50～170μm、缬氨酸200～400μm、瓜氨酸40～150μm、精氨酸60～200μm、酪氨酸180～370μm；各酰基肉碱的浓度分别为：游离肉碱30～70μm、乙酰肉碱20～40μm、丙酰肉碱5～12μm、丁酰肉碱1～3.5μm、异戊酰肉碱0.5～2.0μm、己酰肉碱0.4～1.2μm、辛酰肉碱0.4～1.2μm、葵酰肉碱0.4～1.2μm、月桂酰肉碱0.3～1.0μm、肉豆蔻酰肉碱0.4～1.4μm、棕榈酰肉碱4.0～12.0μm、十八碳酰肉碱1.5～6.0μm、3-羟基异戊酰肉碱0.4～1.2μm、戊二酰肉碱1.0～3.0μm、丙二酰肉碱0.2～1.0μm。
作为上述制备方法的进一步改进，制备血斑质控品步骤中，取70～100μl工作液滴加在载体上。
氨基酸、酰基肉碱既可以单独溶解配置成为相应的标准品溶液，也可以根据需要将多种标准品一并溶解，或分成多组溶解。优选的，根据不同氨基酸、酰基肉碱的溶解特性差异进行分组溶解，这样可以大大减少标准品溶液的配制量，降低配制的难度。
配制时，可以参考美国cdc质控品浓度、实验室临床参考值和红细胞液中的目标氨基酸及酰基肉碱本底浓度，加入目标氨基酸及酰基肉碱标准品，将浓度调节至目标浓度，具体如下：
计算所需配制浓度质控品所需标准品用量
n(理论物质的量)＝c(需要加强的浓度)×v(配制的质控总体积)
m(实际称取量)＝n(理论物质的量)*m(相对分子质量)
计算所需加入标准物质溶液的总体积，计算所需加入生理盐水体积，即得50％红细胞比容质控基质；
v(生理盐水体积)＝v1(红细胞体积)-v2(加入标准物质溶液总体积)。
本领域技术人员也可以使用其他为本领域技术人员熟知的手段进行配制。
浓度单位μm指μmol/l。
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
1)红细胞的分离：
收集健康人源肝素抗凝全血，要求无明显溶血、黄疸、脂肪或污染，以3000r/min的速度离心5min，离心后分出上清液及白膜，加入约红细胞量等量的生理盐水，使用混匀器充分混匀5-7min，3000r/min离心5min后分出上清液及白膜，重复此步骤3次，即得红细胞。使用生理盐水调整红细胞比容为50％，得到红细胞液，测定红细胞液中氨基酸及酰基肉碱本底浓度。
2)氨基酸和酰基肉碱的配制：
使用生理盐水溶解丙氨酸ala、苯丙氨酸phe、亮氨酸lue、甲硫氨酸met、缬氨酸val、瓜氨酸cit、精氨酸arg、酪氨酸tyr共8种氨基酸标准品，得到氨基酸溶液；
使用生理盐水溶解游离肉碱c0、乙酰肉碱c2、丙酰肉碱c3、丁酰肉碱c4、异戊酰肉碱c5、己酰肉碱c6、辛酰肉碱c8、葵酰肉碱c10、3-羟基异戊酰肉碱c5-oh、戊二酰肉碱c5dc、丙二酰肉碱c3dc，得到水溶性酰基肉碱溶液；
使用40v/v％甲醇水溶解月桂酰肉碱c12、肉豆蔻酰肉碱c14、棕榈酰肉碱c16、十八碳酰肉碱c18，得到脂溶性酰基肉碱溶液。
将氨基酸溶液和水溶性酰基肉碱溶液与红细胞液混合，之后滴加脂溶性酰基肉碱溶液，充分混匀，得到混合液。根据红细胞液中氨基酸及酰基肉碱本底浓度，通过调节氨基酸溶液和酰基肉碱溶液的添加量以及生理盐水的添加量，控制氨基酸和酰基肉碱溶液在混合液中的终浓度如表1所示：
表1、目标氨基酸与肉碱配置浓度范围
3)干血斑质控品的制备
使用移液器吸取上一步骤中的混合液85μl，滴加于国际903#滤纸片上，室温下过夜晾干，得到氨基酸和酰基肉碱干血斑质控品。
氨基酸和酰基肉碱干血斑质控品使用自封袋密封，置于-20℃以下，湿度30rh％以下的条件下保存。
下面结合实验，进一步展示本发明方法制得的氨基酸和酰基肉碱干血斑质控品的优势。
氨基酸和酰基肉碱质控干血斑均一性评估
随机抽取氨基酸和酰基肉碱干血斑质控各20个血斑，按照日常检测流程处理样品，使用lc-ms/ms进行测定，计算rsd。实验结果如表2～表5所示：
表2氨基酸干血斑质控(low)均一性评估数据
表3氨基酸干血斑质控(high)均一性评估数据
表4酰基肉碱干血斑质控(low)均一性评估数据
表5酰基肉碱干血斑质控(high)均一性评估数据
实验数据表明：质控品中氨基酸的rsd均在4.00％～15.00％之间，酰基肉碱的rsd均在5.00％～20.00％之间，说明质控基质均匀，均一性良好。
氨基酸和酰基肉碱质控干血斑稳定性评估
血斑晾干保存后，每次实验采用3天的结果，每天检测4组质控，每隔60天，重复此操作，计算其均值、rsd，并进行趋势性分析，以初始3天均值为初始值，计算回收率。结果如表6～9所示：
表6、氨基酸干血斑质控(low)稳定性评估数据
表7、氨基酸干血斑质控(high)稳定性评估数据
表8、酰基肉碱干血斑质控(low)稳定性评估数据
表9、酰基肉碱干血斑质控(high)稳定性评估数据
使用lc-ms/ms对氨基酸和酰基肉碱干血斑质控长期稳定性进行验证，其中氨基酸回收率均在80％～110％之间，酰基肉碱回收率均在80％～120之间，氨基酸和酰基肉碱干血斑质控品在-20℃以下，湿度30rh％以下的条件下，可稳定保存4个月。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。