一种分析真菌毒素联合毒性的细胞电化学传感器的制作方法

本发明涉及一种分析真菌毒素联合毒性的细胞电化学传感器，属于食品质量分析检测领域。

背景技术：

真菌毒素是一些产毒真菌在谷物田间生长阶段、收获和储藏时，或在饲料加工和储藏过程中产生的一组化学性质不同的次级代谢化合物，容易引起人和动物病理变化以及生理病变。目前粮食和饲料受真菌毒素污染非常严重，全球每年受真菌污染而损失的粮食和饲料占总产量的20％-30％，每年有25％谷物被真菌毒素所污染，造成了巨大的经济损失。目前明确能造成人和动物毒害的真菌毒素有200多种，主要有镰刀菌属、曲霉菌属和青霉菌属。在我国饲料检出率高、对动物危害大的是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)、玉米赤霉烯酮(zen)和黄曲霉毒素b1(afb1)。尤其在四川等南方潮湿、多雨、日照短的亚热带湿润气候地区，饲料真菌毒素污染严重，其中don和zen在饲料中的检出率高达100％。然而，人和动物遭受真菌毒素的侵害并非单一的而是混合的，一方面原因是大多数产毒真菌能同时产生多种毒素，另一方面原因是粮食和饲料可能同时受到多种真菌污染，此外由于中国人的饮食习惯摄食食品种类十分丰富使得人们暴露于多种真菌毒素的可能性非常大。因此研究多种真菌毒素的联合毒性、开发出能分析多种真菌毒素联合毒性的设备方法对我国食品安全问题具有重要意义。目前常用于真菌毒素毒性分析的方法主要有：传统细胞形态学观察、细胞增殖活性检测、乳酸脱氢酶检测、dna片段化分析、活性氧产生量测定、凋亡等，这些传统的毒性分析方法操作繁琐外、检验时间较长、成本昂贵，因此急需一种操作简便、快速、成本低廉的分析方法。近些年来将细胞传感器作为毒性分析方法逐渐进入人们的视野。

细胞是形成有机体形态和功能的基本组成单位，对研究机体结构和探索生命活动具有重要意义。细胞传感技术以活细胞作为探测元件，通过对活细胞的基本生理性质或细胞对被测物的响应进行检测，从而定性定量地确定细胞的生理状态或被检物的含量。因此，细胞传感技术对于研究细胞的结构和功能、探索生命的活动和规律、疾病的诊断和治疗、药物的设计和筛选、食品安全的监督和检测等都具有十分重大的意义。随着生命工程技术的发展与信息技术的飞跃，各学科间的交叉融合，使得细胞传感检测研究得到了飞速发展，新型的纳米材料、荧光及电化学细胞传感器不断问世，极大推动了生物传感技术地迅猛发展。虽然，目前已经有些相关报道将细胞利用物理吸附或化学相互作用将细胞固定到电极表面，但是其中大多数研究采用传统玻碳电极，该电极成本高(每根电极不低于700元人民币)、电极修饰过程繁琐、不能同时批量生产。此外，已有报道的这些方法，无法有效模拟细胞在人体内原位生长的实际状态。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述不足，本发明建立了一种便携式细胞电化学传感器成功地用于了多种真菌毒素单独及联合作用的毒性分析研究。本发明先利用层粘连蛋白、金纳米粒子修饰电极，然后将细胞接种到丝网印刷电极表面，再包裹鼠尾胶原制备细胞传感器，其中细胞作为感受元件。本发明还将构建好的细胞传感器用真菌毒素刺激，使用传感器检测阻抗值，通过阻抗值的大小判断细胞受损情况，从而确定真菌毒素的细胞毒性。结合电化学交流阻抗结果与联合指数(ci)方法可以对多种真菌毒素的联合毒性进行分析，从而确定联合作用类型。

本发明的第一个目的是提供一种细胞传感器，所述细胞传感器的构建，是先在工作丝网印刷电极表面电镀沉积金纳米粒子得到金纳米修饰的丝网印刷电极，然后在金层表面修饰上氨基，得到巯基乙胺/金纳米/丝网印刷电极；再将层粘连蛋白固定到电极表面，得到层粘连蛋白/巯基乙胺/金纳米/丝网印刷电极；接种细胞于电极表面，并滴加鼠尾胶原形成3d立体复合物，使细胞固定；将丝网印刷电极与电化学工作站连接，即得到细胞电化学传感器。

在一种实施方式中，所述细胞为人肝癌细胞hepg2。

在一种实施方式中，所述层粘连蛋白的固定，是通过edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)固定。

在一种实施方式中，所述细胞传感器构建的方法如下：

(1)利用循环伏安法在2.5mmfe(cn)6^3-/4-电解液中从-0.2v到0.6v扫描十个循环去除电极表面杂质，后用超纯水清洗丝网印刷碳电极，氮气吹干备用；

(2)在工作丝网印刷电极表面电镀沉积金纳米粒子，电镀方法：工作电极置于1mmol·l^-1氯金酸和0.5mol·l^-1硫酸溶液中，在电位-0.25v电压下，电镀时间为120s，以完成电镀，电镀后用超纯水清洗氮气吹干，得到金纳米修饰的丝网印刷电极；

(3)将金纳米/丝网印刷电极浸入18mmol·l^-1巯基乙胺溶液，室温避光反应4h,使得金层表面修饰上氨基，清洗吹干后得到巯基乙胺/金纳米/丝网印刷电极；

(4)为更好地模拟细胞体内生长环境，将细胞外基质10μl100μg·ml^-1层粘连蛋白通过edc、nhs反应2h固定到电极表面，得到层粘连蛋白/巯基乙胺/金纳米/丝网印刷电极；

(5)随后接种10μl密度为10⁶个·ml^-1人肝癌细胞hepg2于电极表面，滴加10μl鼠尾胶原形成3d立体复合物，37℃过夜5％co2培养箱中过夜培养，待细胞固定后用pbs洗去未固定上的细胞；

(6)将丝网印刷电极与便携式电化学工作站连接，即得到便携式细胞电化学传感器。

本发明的第二个目的是提供一种利用所述细胞传感器快速分析真菌毒素毒性的方法。所述方法，是采用一种真菌毒素单独刺激或者两种以上真菌毒素联合刺激细胞传感器，然后利用电化学交流阻抗方法结合联合指数(ci)方法分析真菌毒素的细胞毒性或者联合作用的作用类型。

在一种实施方式中，所述方法，是利用不同浓度的真菌毒素刺激细胞传感器，然后滴加电解液到细胞传感器上进行测量，得到不同浓度真菌毒素溶液的阻抗值。真菌毒素毒性越大对于细胞传感器得到的阻抗值越小。

在一种实施方式中，所述真菌毒素为脱氧雪腐两道烯醇(don)、玉米赤霉烯酮(zen)、黄曲霉毒素b1(afb1)。

在一种实施方式中，所述联合作用的作用类型包括协同作用、加和作用、拮抗作用。

在一种实施方式中，所述细胞传感器的电化学工作条件如下：细胞传感器进行循环伏安和交流阻抗测试；其中循环伏安条件为：扫描范围：-0.2～0.6v，振幅：0.05v；交流阻抗条件为：初始电位：0.2v，振幅：0.05v，频率范围1hz～100khz。

在一种实施方式中，所述细胞传感器交流阻抗方法如下：电化学工作站在初幅0.05v，频率为1hz～100khz的条件下，在反应介质液为2.5mmol·l^-1fe(cn)6^3-/4-溶液中进行测量，采用eis法，阻抗值通过zview软件拟合并通过最佳等效电路计算。

在一种实施方式中，电化学工作站chi660e配备有一次性可抛丝网印刷碳电极(碳工作电极、碳对电极、银/氯化银参比电极)。

在一种实施方式中，所述方法，将真菌毒素刺激细胞传感器后得到的抑制率代入到联合指数公式中即可判断联合作用类型；其中抑制率(％)＝100[(r鼠尾胶原-r真菌毒素)/(r细胞-r层粘连蛋白)]，其中r层粘连蛋白为电极修饰层粘连蛋白后的阻抗，r细胞为电极修饰细胞后的阻抗，r鼠尾胶原为电极修饰胶原后的阻抗，r真菌毒素为已修饰完的电极在特定浓度真菌毒素溶液刺激后的阻抗。

在一种实施方式中，所述联合作用公式：

式中：d、dm、fa、fu分别为真菌毒素浓度、抑制率为50％时对应的真菌毒素浓度、对细胞损伤效应率(即抑制率)、对细胞未损伤效应率(即1-fa)；m为剂量效应曲线的系数。

ci指数的计算公式为：

式中，(dx)j为真菌毒素单独作用时x％效应浓度，(d)j为真菌毒素联合作用时产生相同的x％效应时各自所需要的浓度，可根据真菌毒素联合时采用的配比求得。如果ci<0.9，则认为真菌毒素联合作用为协同作用；如果ci>1.1，则认为真菌毒素联合作用为拮抗作用；当ci＝0.9-1.1，则真菌毒素联合作用为加和作用。

本发明制备的细胞电化学传感器分析真菌毒素毒相比传统方法具有如下优势：

(1)细胞是形成有机体形态和功能的基本组成单位，对研究机体结构和探索生命活动具有重要意义。本发明构建的细胞电化学阻抗传感器对真菌毒素对人肝癌细胞造成的影响反应快速、灵敏，设备便捷且生产成本较低，再结合电化学阻抗值与联合指数法能快速的判断真菌毒素联合作用的类型及作用程度。本发明通过构建便携式细胞电化学传感器，成功应用于食品中真菌毒素的毒性分析，并在分析真菌毒素联合毒性方面具有良好的应用前景。

(2)利用层粘连蛋白模拟了细胞在体内的生理生存环境，以及采用鼠尾胶原构建三维立体模型更加真实地再现了细胞形态。本发明利用细胞外基质层粘连蛋白生物材料将细胞固定到细胞表面，不仅调高了细胞在电极表面的黏附程度，而且能够更好地模型细胞在人体内原位生长的实际状态，对分析真菌毒素对人体的作用更真实又有研究意义。

(3)肝脏作为真菌毒素的主要代谢器官及毒素作用的靶器官，因此采用人肝癌细胞作为传感器感受元件对研究真菌毒素对机体的毒性具有代表性。当细胞接触真菌毒素时表现为细胞形态改变，随着剂量增大形态变化显著，高剂量时细胞完整性发生改变，细胞膜表面变得粗糙甚至破损，细胞内钙离子升高，细胞凋亡率升高，因此将细胞传感器作为评价或分析真菌毒素毒性的方法大大提高了灵敏度和反应速度。

(4)本发明采用电化学测定阻抗值来作为检测信号，不仅提高了检测的灵敏度而且加快了检测的速度，克服了传统方法的缺点，实现了对真菌毒素毒性及联合作用类型的快速、准确判断。don在0.01-20μg·ml^-1、zen在0.1-50μg·ml^-1、afb1在0.1–3.5μg·ml^-1范围内随着剂量的增加细胞传感器的阻抗值变小，ic50值分别为48.5μg·ml^-1、59.0μg·ml^-1、3.10μg·ml^-1。利用构建的细胞传感器分析三种真菌毒素联合作用类型发现：don与zen表现为协同作用，don与afb1表现为加和作用，zen与afb1表现为拮抗作用，而三者联合表现为拮抗作用。

(5)本发明分析方法分析得到的结果与传统检测方法基本一致，但是真菌毒素在低浓度范围内本发明方法更灵敏；此外本发明方法分析更快速，传统的分析方法如细胞活性检测试(cck-8)需要1-4小时，而本发明方法分析只需要100秒。

(6)本发明方法采用丝网印刷碳电极代替传统玻碳电极，制造成本显著降低，其中丝网印刷电极的成本仅是玻碳电极的十分之一，具有良好的经济效益；丝网印刷电极使用方便并且可以批量生产与修饰，克服了传统电极需要逐一修饰操作繁琐、制备周期长的问题。

(7)本发明的细胞传感器可以对多种真菌毒素的毒性作用类型及作用程度进行判断。目前我国粮食、饲料受多种真菌毒素污染较为严重，尤其是在南方潮湿多雨的地区，多种真菌毒素同时污染形势严峻，克服了已有报道主要针对单一真菌毒素污染的毒性分析、对多种真菌毒性分析缺少研究的问题；本发明不仅可以判断多种真菌毒素同时存在使得毒性作用类型，还可以进一步判断其联合作用的程度，可以为相关检测标准的确立提供参考依据。

附图说明

图1：细胞电化学传感器构建的流程图。

图2：细胞传感器修饰过程电化学表征图：a循环伏安法表征；b差分脉冲伏安法；c交流阻抗法；其中，a裸电极；b金纳米/电极；c巯基乙胺/金纳米/电极；d蛋白/巯基乙胺/金纳米/电极；e细胞/蛋白/巯基乙胺/金纳米/电极；f胶原/细胞/蛋白/巯基乙胺/金纳米/电极。

图3：层粘连蛋白和鼠尾胶原在传感器中作用的电化学表征；a：a巯基乙胺/金纳米/电极，b细胞/巯基乙胺/金纳米/电极；b：a蛋白/巯基乙胺/金纳米/电极，b细胞/蛋白/巯基乙胺/金纳米/电极；c：有胶原包裹细胞修饰的电极；d无胶原包裹细胞修饰的电极，随时间延长的阻抗值变化：a0h，b12h，c24h，d36h，e48h，f60h，g72h。

图4：不同浓度don、zen、afb1刺激肝癌细胞24h后分别利用eis和cck-8进行毒性分析；a：don:0.01、0.5、1、10、20、40和50μg·ml^-1；b：zen:0.1、1、5、10、20、30、40和50μg·ml^-1；c：afb1:0.1、1、2.5、2.8、2.9、3、3.1、3.2和3.5μg·ml^-1。

图5：真菌毒素对细胞形态的影响；a：阴性对照；b：don1μg·ml^-1；c：zen20μg·ml^-1；d：afb12.9μg·ml^-1；刺激24h。

具体实施方案

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1细胞电化学传感器的制备

(1)利用循环伏安法在2.5mmfe(cn)6^3-/4-电解液中从-0.2v到0.6v扫描十个循环去除电极表面杂质，后用超纯水清洗丝网印刷碳电极，氮气吹干备用；

(2)在工作丝网印刷电极表面电镀沉积金纳米粒子，电镀方法：工作电极置于1mmol·l^-1氯金酸和0.5mol·l^-1硫酸溶液中，在电位-0.25v电压下，电镀时间为120s，以完成电镀，电镀后用超纯水清洗氮气吹干，得到金纳米修饰的丝网印刷电极；

(3)将金纳米/丝网印刷电极浸入18mmol·l^-1巯基乙胺溶液，室温避光反应4h,使得金层表面修饰上氨基，清洗吹干后得到巯基乙胺/金纳米/丝网印刷电极；

(4)为更好地模拟细胞体内生长环境，将细胞外基质10μl100μg·ml^-1层粘连蛋白通过edc、nhs反应2h固定到电极表面，得到层粘连蛋白/巯基乙胺/金纳米/丝网印刷电极；

(5)随后接种10μl密度为10⁶个·ml^-1人肝癌细胞hepg2于电极表面，滴加10μl鼠尾胶原形成3d立体复合物，37℃过夜5％co2培养箱中过夜培养，待细胞固定后用pbs洗去未固定上的细胞；

(6)对制备好的细胞电化学传感器进行循环伏安法、差分脉冲伏安法和交流阻抗法表征。伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0.6v；交流阻抗法条件为：频率范围1hz～100khz。在细胞传感器的构建过程中，对吸附细胞的浓度进行了优化以获得稳定的细胞传感器，结果当细胞浓度达到1×10⁶ml^-1时，电极测得的ret不再发生持续变化，说明此时电极表面以达到吸附饱和，细胞的最佳吸附浓度为1×10⁶ml^-1。如图2所示，金纳米修饰电极后的电信号比未修饰的裸电极明显增强，说明了金纳米具有良好的导电性，细胞吸附到修饰电极后，由于细胞膜的绝缘性，电信号明显降低，如图2所示，表明细胞吸附到了修饰电极表面，证明细胞传感器成功制备。

实施例2细胞电化学传感器的应用

1、真菌毒素刺激细胞传感器

分别取don在0.01-20μg·ml^-1、zen在0.1-50μg·ml^-1、afb1在0.1–3.5μg·ml^-1范围的真毒毒素，以及don+zen(0.01+5,0.5+10,1+20,10+40，20+50μg·ml^-1),don+afb1(0.01+2.5,0.5+2.8,1+2.9,10+3,20+3.1μg·ml^-1),zen+afb1(5+2.5,0+2.8,20+2.9,40+3,50+3.1μg·ml^-1),don+zen+afb1(0.01+5+2.5,0.5+10+2.8,1+20+2.9,10+40+3,20+50+3.1μg·ml^-1)刺激传感器，测量相应的阻抗值。

2、分析条件与方法

频率为1hz～100khz的条件下，在反应介质液为2.5mmol·l^-1fe(cn)6^3-/4-溶液中进行测量，采用eis法，阻抗值通过zview软件拟合并通过最佳等效电路计算。

抑制率(％)＝100[(r鼠尾胶原-r真菌毒素毒素)/(r细胞-r层粘连蛋白)]

r层粘连蛋白：电极修饰层粘连蛋白后的阻抗，r细胞：电极修饰细胞后的阻抗，r鼠尾胶原：电极修饰胶原后的阻抗，r真菌毒素：已修饰完的电极在特定浓度真菌毒素溶液刺激后的阻抗。将真菌刺激细胞传感器后得到的抑制率代入到联合指数公式中即可判断联合作用类型。联合作用公式：

式中：d、dm、fa、fu分别为真菌毒素浓度、抑制率为50％时对应的真菌毒素浓度、对细胞损伤效应率、对细胞未损伤效应率；m为剂量效应曲线的系数。ci指数的计算公式为：

式中，(dx)j为真菌毒素单独作用时x％效应浓度，(d)j为真菌毒素联合作用时产生相同的x％效应时各自所需要的浓度，可根据真菌毒素联合时采用的配比求得。如果ci<0.9，则认为真菌毒素联合作用为协同作用；如果ci>1.1，则认为真菌毒素联合作用为拮抗作用；当ci＝0.9-1.1，则真菌毒素联合作用为加和作用。

3、结果判断

发明采用电化学测定阻抗值来作为检测信号，不仅提高了检测的灵敏度而且加快了检测的速度，克服了传统方法的缺点，实现了对真菌毒素毒性及联合作用类型的快速、准确判断。don在0.01-20μg·ml^-1、zen在0.1-50μg·ml^-1、afb1在0.1–3.5μg·ml^-1范围内随着剂量的增加细胞传感器的阻抗值变小，ic50值分别为48.5μg·ml^-1、59.0μg·ml^-1、3.10μg·ml^-1。结果如表1所示。表1结果显示，利用构建的细胞传感器分析三种真菌毒素联合作用类型发现：don与zen表现为协同作用，don与afb1总体表现为加和作用，zen与afb1表现为拮抗作用，而三者联合表现为拮抗作用。构建的细胞传感器方法被传统增殖活性实验所验证。

表1细胞传感器分析真菌毒素联合作用的ci指数值

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。