一种用于混合淋巴细胞共培养试验检测的方法和试剂盒与流程

本发明属于检验技术领域，具体涉及一种用于混合淋巴细胞共培养试验检测的方法和试剂盒。

背景技术：

将两个遗传不同的个体之淋巴细胞在体外混合共同培养时，因其表面的组织相容性抗原不同而相互刺激，会导致对方淋巴细胞分裂增殖和转化，这种反应称为双向混合淋巴细胞培养(twowaymlc)；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素c(mytomycinec)处理或射线照射使之细胞中dna失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(onewaymlc)。主要组织相容性复合体(mhc)和/或m位点基因编码的细胞表面抗原是这种反应的主要刺激物，反应细胞为t细胞。根据淋巴细胞反应的强度，可评价两者组织相容性抗原的差异程度以及淋巴细胞对同种异体细胞的反应能力。因此，混合淋巴细胞反应常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体mhc相容的程度；以及药物及移植物的免疫排斥作用检测，以评估其使用风险。由于混合淋巴细胞培养中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进自然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞和细胞毒性t淋巴细胞等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。此外，混合淋巴细胞反应还可用于检测其他细胞或外界刺激物作用下，t细胞的增殖情况。简言之，与对照组相比，t细胞增殖增多意味着待测物能够促进t细胞反应；t细胞增殖减少则意味着待测物能够抑制t细胞反应。

然而目前，国内外并没有混合淋巴细胞共培养试验检测的成品试剂盒，导致各医院、高校、科研院所、第三方检验机构进行本试验检测时困难重重，需要进行大量前期实验条件摸索；且由于参考文献不同等原因，可能导致不同机构进行检测时所用实验方法不同，因此检测结果差异性很大。因此，有必要提供一种用于混合淋巴细胞共培养试验检测的方法和试剂盒以克服上述缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对目前国内外市场上没有混合淋巴细胞共培养相关的试剂盒的现状，研发一种新型的用于混合淋巴细胞共培养试验检测的试剂盒。本发明的方法和试剂盒基于羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester,cfse)染色结合流式细胞分析法检测混合淋巴细胞共培养结果，其主要原理为(参见图1)：利用丝裂霉素c(mitomycinc)预先处理刺激细胞(刺激细胞与第二种淋巴细胞表面主要组织相容性复合体不同，可以为淋巴细胞或其他细胞，例如eb病毒转化的b淋巴母细胞(如n23细胞株，经过克隆化)、htc细胞或pbmc细胞等)，使刺激细胞中dna失去复制能力，不再进行增殖，但仍能刺激第二种淋巴细胞(可以为淋巴细胞或分离纯化的t淋巴细胞等)的活化，进一步的，利用cfse标记第二种淋巴细胞，并将其与mitomycinc预处理的刺激细胞共同培养3-5天后，即可通过流式细胞术检测经cfse标记的第二种淋巴细胞的增殖情况。本发明的技术方案具体如下：

根据本发明的第一个方面，一种用于混合淋巴细胞共培养试验检测的方法，包括以下步骤：

第一步，将刺激细胞利用丝裂霉素c处理；

第二步，将第二种淋巴细胞利用cfse荧光染料染色；

第三步，将经丝裂霉素c处理的刺激细胞与经cfse荧光染料染色的第二种淋巴细胞共同培养；

第四步，使用流式细胞术检测第二种淋巴细胞的增殖情况；

其中，所述刺激细胞与所述第二种淋巴细胞表面主要组织相容性复合体不同。

根据本发明，所述刺激细胞包括淋巴细胞或其他细胞，所述其他细胞包括eb病毒转化的b淋巴母细胞、htc细胞或pbmc细胞等，所述第二种淋巴细胞包括淋巴细胞或分离纯化的t淋巴细胞等。

根据本发明，所述丝裂霉素c的终浓度为5-100μg/ml，优选的，所述丝裂霉素c的终浓度为10μg/ml。

根据本发明，所述cfse荧光染料的终浓度为1-10μm，优选的，所述cfse荧光染料的终浓度为5μm。

根据本发明，所述经丝裂霉素c处理的刺激细胞与经cfse荧光染料染色的第二种淋巴细胞按照1:1-1:20的比例共同培养。

根据本发明，所述共同培养的时间为3-5天。

根据本发明的第二个方面，一种用于混合淋巴细胞共培养试验检测的试剂盒，所述试剂盒包含丝裂霉素c和cfse荧光染料。

根据本发明，所述丝裂霉素c的终浓度为5-100μg/ml，优选的，所述丝裂霉素c的终浓度为10μg/ml。

根据本发明，所述cfse荧光染料的终浓度为1-10μm，优选的，所述cfse荧光染料的终浓度为5μm。

本发明的方法和试剂盒能够用于混合淋巴细胞共培养试验检测，具有如下优点：

1)操作简单，仅需按照产品说明书进行简单操作即可，无需特别的实验技巧，可操作性强；

2)利用cfse染色法结合流式细胞术法检测淋巴细胞的增殖情况，精确度高；

3)流式检测法可直观真实地反应淋巴细胞的增殖情况，不受操作者主观判断影响，结果可重复性强；

4)所需样本量少，检测结果清晰，特异性强，易于分析；

5)成本低，推广性强。

本发明提供了可用于混合淋巴细胞共培养试验的检测的方法和试剂盒，适用于器官移植前的组织配型试验，免疫力低下患者的免疫功能检测，药物及移植物的免疫排斥作用检测，其他细胞或外界刺激物对于t淋巴细胞活化的影响检测，对影响t细胞活化能力的药物筛选，以及其他免疫调节试验研究等。本发明的方法和试剂盒不仅限于人类样本的检测，还可用于其他物种混合淋巴细胞共培养的检测，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、猪等，具有广泛的工业应用价值。

附图说明

图1为本发明的方法的原理示意图。

图2为实施例1的操作说明示意图。

图3为实施例1的实验结果示意图。

图4为实施例2的操作说明示意图。

图5为实施例2的实验结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1

通过本发明的方法和试剂盒可检测受试者器官移植前的组织配型试验，以判定受试者是否适于接受本次器官移植，预测移植后发生排斥的风险。通常需要获取器官移植提供者(以下简称供体)及器官移植接受者(以下简称受体)的新鲜外周静脉血进行试验。

如图2所示，本实施例的具体操作步骤如下：

第一步，供体淋巴细胞的制备：

1)取供体新鲜外周静脉血，与pbs按照1：1的比例稀释。沿管壁徐徐滴流叠加盛有1/2体积的淋巴细胞分离液的试管内(注意不要破坏液面分层)，然后2000rpm水平离心20min。管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用pbs洗两次，每次1500rpm离心10min。台盼蓝染色，计数板计数。调整细胞密度为1～2×10⁶/ml，离心，留取沉淀。

2)向上述细胞中加入1μl丝裂霉素(终浓度10μg/ml)和1mlpbs，37℃水浴30min，pbs离心洗涤2次。

3)用含10％fbs的rpmi1640液调整细胞密度为1×10⁷/ml，标记为d。

第二步，受体淋巴细胞的制备：

1)取受体新鲜外周静脉血，与pbs按照1：1的比例稀释。沿管壁徐徐滴流叠加盛有1/2体积的淋巴细胞分离液的试管内(注意不要破坏液面分层)，然后2000rpm水平离心20min。管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用pbs洗两次，每次1500rpm离心10min。台盼蓝染色，计数板计数。

2)将上述细胞用含有5％fbs的1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁷/ml。加入终浓度为5μm的cfse溶液，37℃避光水浴5min。然后利用预冷的含5％fbs的pbs洗涤2次。

3)用含有10％fbs的prmi1640重悬上述细胞，调整细胞密度为1×10⁷/ml，标记为r。

第三步，混合淋巴细胞培养

将上述已制备好的r和d按如下分组加入96孔板，置37℃，5％co2的培养箱中培养3-5天。

实验组：r(50μl)+d(50μl)；

对照组：r(50μl)；

每组3个复孔，空白对照组为rpmi1640培养液100μl。

第四步，流式细胞术检测淋巴细胞的增殖情况

通过流式细胞术，通过设门圈出淋巴细胞群，并分析淋巴细胞的增殖情况。结果以刺激指数(stimulationindices,si)表示，si＝实验组淋巴细胞增殖百分比-对照组淋巴细胞增殖百分比。

检测结果如图3所示，对照组细胞没有或仅有少量淋巴细胞增殖，实验组有大量淋巴细胞增殖。若si值大于10，则提示供体与受体二者配型可能不符，不适宜进行后续的器官移植。

实施例2

通过本发明的方法和试剂盒可检测受试者t淋巴细胞功能是否低下，通常需要获取受试者的新鲜外周静脉血进行试验。

如图4所示，本实施例的具体操作步骤如下：

第一步，刺激细胞的制备：

1)常用的刺激细胞有eb病毒转化的b淋巴母细胞(如n23细胞株，经过克隆化)、htc细胞或pbmc细胞等。以n23细胞为例，取处于对数生长期的n23细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中，台盼蓝染色，计数板计数。

2)向上述细胞中加入1μl丝裂霉素(终浓度10μg/ml)和1mlpbs，37℃水浴30min，pbs离心洗涤2次。

3)用含10％fbs的rpmi1640液调整细胞密度为1×10⁷/ml。标记为s。

第二步，受试者外周血pbmc细胞的制备：

1)取受试者个体新鲜外周静脉血，与pbs按照1：1的比例稀释。沿管壁徐徐滴流叠加盛有1/2体积的淋巴细胞分离液的试管内(注意不要破坏液面分层)，然后2000rpm水平离心20min。管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用pbs洗两次，每次1500rpm离心10min。台盼蓝染色，计数板计数。

2)将上述细胞用含有5％fbs的1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁷/ml。加入终浓度为5μm的cfse溶液，37℃避光水浴5min。然后利用预冷的含5％fbs的pbs洗涤2次。

3)用含有10％fbs的prmi1640重悬上述细胞，调整细胞密度为1×10⁷/ml，标记为u。

第三步，混合淋巴细胞培养

将已制备好的s和u按照20:1的比例，如下分组加入96孔板，置37℃，5％co2的培养箱中培养3-5天。

实验组：u(2×10⁵个细胞)+s(1×10⁴个细胞)；

对照组：u(2×10⁵个细胞)

每组3个复孔，空白对照组为rpmi1640培养液200μl。

第四步，流式细胞术检测淋巴细胞的增殖情况

利用cd3、cd8流式抗体标记培养细胞，通过流式细胞术，通过设门圈出各类t淋巴细胞群，并分析t淋巴细胞的增殖情况。结果以刺激指数(stimulationindices,si)表示，si＝实验组淋巴细胞增殖百分比-对照组淋巴细胞增殖百分比。

检测结果如图5所示，对于t淋巴细胞功能正常的健康人来说，对照组细胞没有或仅有少量淋巴细胞增殖，实验组有大量淋巴细胞增殖；对于t淋巴细胞功能缺陷患者来说，对照组及实验组细胞均没有或仅有少量淋巴细胞增殖。