一种基于T‑Hg(Ⅱ)‑T结构的AgNCs探针超灵敏检测汞离子的方法与流程

文档序号:12303611
一种基于T‑Hg(Ⅱ)‑T结构的AgNCs探针超灵敏检测汞离子的方法与流程

本发明涉及一种Hg2+检测方法,特别涉及一种基于DNA为模板合成DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针,并利用DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针对Hg2+特异性荧光检测的方法,属于生物传感技术领域。



背景技术:

重金属汞离子以无机盐和有机配合物以及金属水银的形态广泛存在于大自然中。汞离子在生物体内容易通过食物链进行堆积,导致脑,肝和中枢神经系统受到永久性的伤害。美国环保局(EPA)严格地界定了饮用水中汞离子的浓度≤10nM。目前对金属汞离子的微量检测成为了一个迫不及待解决的问题,传统可靠的金属汞离子检测方法主要是基于原子吸收/发射光谱法。然而,此类方法耗时且耗费大量设备。近些年来,许多的团队一直致力于金属离子在环境和生物系统中引用荧光金属纳米团簇(NCs)作为新的感应探针的研究,并且有文献报道通过金属离子与银纳米簇发生荧光猝灭(DNA/AgNCs)(Peng,J.,et al.,Sensitive detection of mercury and copper ions by fluorescent DNA/Ag nanoclusters in guanine-rich DNA hybridization.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc,2015.137:p.1250-7.)或者于核酸链上标记荧光素实现对微量汞离子的荧光检测(Zhang,H.,et al.,Hg2+-triggered exonuclease III-assisted dual-cycle targets recycling amplification for label-free and ultrasensitive colorimetric detection of Hg2+.Sensors and Actuators B:Chemical,2017.246:p.896-903.)。此类方法最大的缺陷是利用荧光猝灭对汞离子进行检测准确度低,另外需要荧光素进行标记的荧光探针,成本高,合成复杂,检测限高,检测线性窄。



技术实现要素:

针对现有的检测水样中Hg2+浓度的方法存在的缺陷,本发明的目的是在于提供一种免标记、信号好、特异性强、灵敏度高、检测浓度范围广并且检测限低的对Hg2+特异性荧光检测的方法。

为了实现上述技术目的,本发明提供了一种基于T-Hg(Ⅱ)-T结构的AgNCs探针超灵敏检测汞离子的方法,该方法包括以下步骤:

1)以DNA1为模板合成DNA1-AgNCs;

2)所述DNA1-AgNCs与DNA2杂交结合,得到DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针;

3)所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与一系列不同浓度的Hg2+标准溶液反应后,进行荧光检测,得到一系列荧光信号值,建立Hg2+溶液浓度与荧光信号值的标准曲线;

4)将DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与待测Hg2+溶液反应后,进行荧光检测,得到荧光信号值,并根据标准曲线,计算出待测Hg2+溶液的浓度;

所述DNA1包含与DNA2杂交互补的片段、合成AgNCs的模板片段以及与Hg2+特异性结合的片段;

所述DNA2包含与DNA1杂交互补的片段、使AgNCs荧光增强的片段以及与Hg2+特异性结合的片段。

本发明的技术方案关键在于采用DNA作为模板合成AgNCs银纳米簇荧光探针,再利用AgNCs银纳米簇荧光探针对Hg2+特异性荧光检测。先利用DNA1作为模板合成银纳米簇(DNA1中包含了合成纳米银簇的模板片段),待荧光稳定之后,在体系中加入DNA2(DNA2中包含了与DNA1杂交互补的片段、使银纳米簇荧光增强的片段以及连续胸腺嘧啶(thymine,T)或连续T之后增加一定的重复AGC序列)。当体系中再加入DNA2之后,DNA1与DNA2部分互补发生杂交,DNA2中部分鸟嘌呤(guanine,G)靠近银纳米簇,使荧光信号增强。再在体系中加入Hg2+,DNA1和DNA2链中的胸腺嘧啶T与加入的Hg2+特异性结合形成稳定的T-Hg2+-T,有利于DNA1和DNA2链拉直,使得DNA2中的鸟嘌呤G更靠近AgNCs,从而导致荧光信号明显增强。因此,整个体系的荧光随着汞离子浓度的增加呈现逐渐增强的趋势。利用该原理,实现了Hg2+特异性荧光检测,并且在0.00002nM~0.16nM范围之间体系荧光强度随着浓度的增加呈线性增强。此荧光探针与传统光谱方法相比较对汞离子的检测,此荧光探针的检测线性范围相对更宽,检测限更低。

优选的方案,所述DNA1的序列号为:5'-TTTTTTCCCCCTAATTCCCAA AGCTCGACGGATT-3'。

优选的方案,所述DNA2的序列号为:5'-AATCCGTCGAGCAGGGGAAGGGGAAGGGTTTTTT-3',或者为5'-AATCCGTCGAGCAGGGGAAGGGGAAGGGTTTTTTCGACGACGACGACGACGACGACGACGACGA-3'。

本发明的DNA1和DNA2可以于上海生物工程有限公司购买。两者的序列如下:DNA1:5'-TTTTTTCCCCCTAATTCCCAA AGCTCGACGGATT-3';DNA2:5'-AATCCGTCGAGCAGGGGAAGGGGAAGGGTTTTTT-3'或5'-AATCCGTCGAGCAGGGGAAGGGGAAGGGTTTTTTCGACGACGACGACGACGACGACGACGACGA-3';根据上述的DNA序列可知,DNA1和DNA2均由三部分组成:DNA1中3'端12个碱基和DNA2中5'端12个碱基进行完全互补;DNA1的中间部CCCCCTAATTCCCAAA片段作为合成银纳米簇的模板,DNA2的中间部分AGG GGA AGGGGAAGGG为富含G碱基的部分,主要用于增大荧光信号,当鸟嘌呤G靠近银纳米簇时使荧光信号增强;DNA1中5'端和DNA2中3'端均是6个胸腺嘧啶T。此外,在DNA2核酸序列设计时,通过实验证实在DNA2的3'末端增加一定和DNA1非互补的碱基序列,可以拓宽荧光探针对汞离子的检测区间,以及增强汞离子检测的准确度。当DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针加入Hg2+之后,DNA1和DNA2链中的胸腺嘧啶T和Hg2+特异性结合形成稳定的刚性结构T-Hg2+-T,使DNA1的5'端和DNA2的3'端进行结合形成直线型刚性结构。此时DNA2链中间部分的AGGGGA重复序列更加靠近模板银纳米簇,整个体系的荧光随着汞离子浓度的增加呈现逐渐增强的趋势,因此探针的荧光会随着汞离子浓度的增加而增强。特别是在T-Hg2+-T结构的尾端增加一定的拉力(不同AGC重复序列)时,可以提高探针对汞离子的检测灵敏度,使检测区间更宽。

优选的方案,将溶有DNA1的磷酸缓冲液与AgNO3溶液混合后,加入NaBH4溶液混匀,在20~30℃恒温下反应1~3h,即得DNA1-AgNCs。更优选的合成DNA1-AgNCs的方法:先将DNA1与硝酸银溶液、磷酸缓冲液(20mM,pH=7.0)室温下震荡混匀15min,随后加入新鲜配制的硼氢化钠,迅速震荡混匀,随后置于25℃恒温水浴箱中反应2h,即可检测其荧光信号。经实验证明此方法合成银纳米簇仅需2h,整个DNA1-AgNCs体系2h即可达到稳定。

较优选的方案,DNA1、AgNO3和NaBH4的摩尔比为1:5~7:5~7。更优选为1:6:6。

优选的方案,所述DNA1-AgNCs银纳米簇与DNA2等摩尔比混合,在室温下反应,即得DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针。本发明的技术方案中采用的DNA2与DNA1核酸序列中各自有12个连续的可以杂交互补的碱基序列。当两条DNA链进行混匀一定时间之后,两链的12个碱基会一一进行互补配对。经过实验证明,两链进行互补配对所需的时间为1h,也即DNA1-AgNCs与DNA2整个溶液混合反应1h之后,体系达到完全的稳定,即得到检测汞离子的荧光探针DNA1/DNA2-AgNCs。

优选的方案,步骤3)中,所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与标准Hg2+溶液在室温下反应3~6min。

优选的方案,步骤4)中,所述DNA1/DNA2-AgNCs荧光探针与待测Hg2+溶液在室温下反应3~6min。

相对现有技术,本发明的技术方案带来的有益技术效果:

本发明的技术方案通过构建特殊的银纳米簇荧光探针DNA1/DNA2-AgNCs,实现了对Hg2+特异性的荧光检测,具有免标记、信号好、特异性强、灵敏度高、检测浓度范围广、检测限低等优点,有利于推广应用。

本发明的技术方案通过两条包含杂交互补片段的特殊DNA链构建银纳米簇荧光探针DNA1/DNA2-AgNCs,再利用Hg2+与胸腺嘧啶T特异性结合的特点,来进行Hg2+的检测。Hg2+与银纳米簇荧光探针中的DNA1中5'端和DNA2中3'端的胸腺嘧啶T特异性结合,形成直线型T-Hg2+-T刚性结构;两条DNA链中碱基杂交的部位因碱基之间的作用力呈现螺旋状;两DNA链的中间部分,由于T-Hg2+-T结构的形成引起DNA1中5'端和DNA2中3'端的链拉直,使DNA2链中间的AGGGGA部分更加靠近银纳米簇,从而使整个荧光探针荧光信号发生增强。DNA1/DNA2-AgNCs整个体系的荧光随着汞离子浓度的增加而增强,具有信号强、特异性高等的特点,且对Hg2+响应范围宽,适用于0.00002nM~0.16nM浓度范围的Hg2+检测,对Hg2+检测灵敏度非常好,检测限达到了0.00002nM。此外,通过对互补DNA2链的长度进行调控,发现在DNA2序列连续胸腺嘧啶(thymine,T)尾端增加不同碱基数的拖尾,能够明显拓宽汞离子的检测区间,此荧光探针对汞离子的检测浓度范围适用于0.00002nM~1.6nM,远远低于EPA最低浓度含量要求的检测。

本发明的技术方案银纳米簇荧光探针通过DNA核酸序列来稳定银纳米粒子,其稳定性好,且银纳米簇的尺寸小,耐环境影响力强;并且应用DNA的高选择性和特异性的特点可以有效改善上述灵敏度低和检测限低的问题。

本发明的技术方案利用银纳米簇荧光探针对Hg2+的检测,具有快速、高效,准确的特点,仅需5min作用即可达到稳定的检测,检测的结果准确性高。

本发明通过荧光信号变化检测Hg2+与现有的电化学方法检测Hg2+相比较具有明显的技术优势,如性质更稳定,操作更为简便,检测的灵敏度高,并且检测的范围宽,检测限低。

本发明的技术方案首先利用Hg2+与胸腺嘧啶T特异性结合,再利用T-Hg2+-T结构的形成,实现对鸟嘌呤G与银纳米簇的距离进行调控,从而控制荧光探针的荧光强度,因此实现对目标物进行检测。

附图说明

【图1】为基于T-Hg(Ⅱ)-T结构的AgNCs探针超灵敏检测汞离子的方法的示意图;

【图2】为实施例1在一定浓度范围内检测Hg2+含量的荧光图;

【图3】为实施例1在一定浓度范围内检测Hg2+浓度和荧光值的关系图;

【图4】为实施例1在一定浓度范围内检测Hg2+含量的标准曲线线性关系图;

【图5】为实施例2在一定浓度范围内检测Hg2+浓度和荧光值的关系图;

【图6】为实施例2在一定浓度范围内检测Hg2+含量的标准曲线线性关系图。

具体实施方式

以下实施旨在进一步说明本发明内容,而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

采用的DNA1序列号为:5'-TTTTTTCCCCCTAATTCCCAAAGCTCGACGGATT-3';

采用的DNA2序列号为:5'-AATCCGTCGAGCAGGGGAAG GGGAAGGGTTTTTT-3';

DNA1-AgNCs的制备方法,步骤如下:

取33μL的DNA1(100μM),DNA1用pH=7.4,10mM的磷酸缓冲液溶解(未使用之前已经完成离心的DNA1溶液放置在4℃的冰箱里面储存)。接着将160μL磷酸缓冲液(20mM,pH=7.0)与上述的33μL DNA1混匀,混匀溶液中加入13.2μL AgNO3水溶液(1.5mM),上述整个混合溶液于室温下用混匀器持续震荡混匀15min(1000r/min),然后取13.2μL新鲜配制的NaBH4(1.5mM)溶液迅速加入至上述混合溶液中,并将整个溶液混匀30s,然后将整个溶液置于25℃恒温水浴锅中反应2h,待反应完全后测定合成的DNA1-AgNCs银纳米簇的荧光。

DNA1/DNA2-AgNCs合成步骤如下:

上述的DNA1-AgNCs合成待荧光稳定之后,1:1往DNA1-AgNCs溶液中加入23μL DNA2(100μM),待整个溶液反应1h,整个DNA1/DNA2-AgNCs的荧光达到稳定,即可检测其荧光信号。

Hg(NO3)2溶液的配制步骤如下:

根据文献介绍,硝酸汞及其不易溶于水,因此在配制硝酸汞溶液的时候采用以下方法进行配制:准确称量0.0223g Hg(NO3)2加入10μL 0.1M HNO3进行溶液,待溶液稳定之后用超纯水定容至100mL,最终得到浓度为0.65mM Hg(NO3)2溶液。

Hg2+的检测步骤如下:

待上述的DNA1/DNA2-AgNCs的荧光探针荧光稳定之后,将合成好的DNA1/DNA2-AgNCs溶液进行等体积分管,再取相同体积不同浓度的硝酸汞溶液分别加入至上述分管的DNA1/DNA2-AgNCs溶液中,整个溶液混匀反应5min,测定溶液中DNA1/DNA2-AgNCs荧光信号的变化。

Hg2+荧光标准曲线建立的步骤如下:

上述汞离子检测步骤中检测许多不同Hg2+浓度的水溶液,每一个浓度的Hg2+将出现一个荧光峰值,重复4次实验,得出的数据用origin进行线性拟合,拟合出相应的logcHg2+-Fluorescence intensity标准曲线图。

检测Hg2+待测溶液步骤如下:

用自来水配制不同浓度Hg2+待测溶液,取和硝酸汞溶液相同体积的待测溶液于DNA1/DNA2-AgNCs溶液中,根据已知浓度的待测汞离子溶液测定的荧光值,将得到的荧光值代入已知的标准曲线当中,计算出待测溶液中含有Hg2+的浓度。

从图2中可以看出荧光信号随着Hg2+浓度增大而增大。

从图4中可以看出在0.00002nM~0.16nM的浓度范围内Hg2+与其所对应的响应信号有一定的线性关系。

实施例2

操作步骤及实验条件与实施例1相同,仅将DNA2序列号替换成5'-AATCCGTCGAGCAGGGGAAGGGGAAGGGTTTTTTCGACGACGACGACGACGACGACGACGACGA-3'。

从图5中可以看出在0.00002nM~1.6nM的浓度范围内Hg2+与其所对应的响应信号有一定的线性关系。

再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1