FNDC3B的用途、诊断肺腺癌的试剂盒及肺组织中FNDC3B表达水平的检测方法与流程

本发明属于医学和分子生物学技术领域，具体涉及一种fndc3b的用途、诊断肺腺癌的试剂盒及肺组织中fndc3b表达水平的检测方法。

背景技术：

目前肺癌仍然是全球癌症死亡的首要原因，约占所有癌症相关死亡量的20%，而且肺癌的五年生存率一直小于30%。肺腺癌是肺癌组织学类型的一种，属于非小细胞癌。目前肺腺癌是肺癌中发病率最高的一种，肺腺癌已经占到非小细胞肺癌70~80%左右，尽管目前连续治疗在肿瘤治疗中发挥了一定的作用，但肺腺癌仍在全球癌症相关死亡中占有一定的比例，因此，肺腺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。

肺腺癌的筛查，是指对那些没有肺癌相关症状的人群进行常规体检，在出现症状前及时发现肺腺癌，如果可以找到肺腺癌分子标志物，对于提示临床医生早期对患者采取相关的治疗措施或者决策具有重要的意义。

fndc3b，是ⅲ型纤维连接蛋白域蛋白3b，与机体创伤修复、组织炎症、纤维化及硬化过程等有密切关系。目前，关于fndc3b与肺癌的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种fndc3b的用途、诊断肺腺癌的试剂盒及肺组织中fndc3b表达水平的检测方法，通过检测fndc3b的表达水平，可以判断待检者患肺腺癌的风险，可用于临床肺腺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种fndc3b的用途，用于制备检测肺腺癌的试剂盒。

其中，所述试剂盒包括：检测肺组织中fndc3b表达水平的试剂。

优选的，所述试剂为免疫组化检测方法用fndc3b抗体，也可以为westernblot或elisa检测方法用fndc3b抗体。

本发明实施例还提供一种检测肺腺癌的试剂盒，包括一容器，所述容器内设有检测肺组织中fndc3b表达水平的试剂，还设有空白液、稀释液、抗原修复液等。

其中，所述试剂为免疫组化检测方法用fndc3b抗体，也可以为westernblot或elisa检测方法用fndc3b抗体。

本发明实施例还提供一种肺组织中fndc3b表达水平的免疫组化检测方法，包括如下步骤：

（1）封闭过氧化物酶：取肺腺癌患者石蜡切片和远端正常肺组织石蜡切片进行脱蜡，脱蜡至水化后，用3%h2o2溶液于暗处封闭内源性过氧化物酶，室温孵育12~20min；

（2）蒸馏水漂洗：切片置于蒸馏水中，洗2~5次，每次3~8min；

（3）抗原修复：加入抗原修复液，在90~100℃水浴锅中水浴，进行抗原修复；

（4）蒸馏水漂洗：取出切片，自然冷却至室温后，用蒸馏水洗2~5遍；

（5）孵育一抗：用免疫组化笔将组织圈住，在圈内滴加fndc3b抗体稀释液，4℃孵育过夜；

（6）蒸馏水漂洗：用蒸馏水洗2~5遍；

（7）滴加二抗：滴加dakohrp标记的二抗工作液，室温孵育50~70min；

（8）蒸馏水漂洗：蒸馏水2~5次，每次3~8min；

（9）dab显色：滴加显色底物dab，在显微镜下观察显色情况，于蒸馏水中终止反应；

（10）苏木素复染：将切片放入苏木素染液中染色1~3min，1%盐酸酒精分化后，流水冲洗8~15min；

（11）脱水透明：经80%、95%、100%梯度酒精脱水、二甲苯透明,于通风厨中干燥；

（12）封片：用中性快干胶封片，在光学显微镜下观察，图像采集系统采图；采图后，根据肺癌患者和远端组织的肿瘤细胞染色强度及阳性面积给予免疫组化评分。

其中，步骤（3）中的抗原修复液为ph8.0的tris-edta、ph6.0的柠檬酸钠溶液中的一种；

步骤（5），所述fndc3b抗体稀释液由fndc3b抗体与抗体稀释液混合配制，所述fndc3b抗体与抗体稀释液的体积比为1:200。

其中，步骤（1）中，肺腺癌患者石蜡切片和远端正常肺组织石蜡切片的脱蜡过程依次为：甲苯ⅰ10min、二甲苯ⅱ10min、无水乙醇5min、95%乙醇5min、90%乙醇5min、90%乙醇5min以及75%乙醇5min。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明通过检测肺异常者的肺部异常部位与正常部位的fndc3b蛋白表达水平，以判断肺异常者的fndc3b蛋白表达水平差异，进而判断待检者患肺腺癌的风险：若fndc3b蛋白的表达水平高，则患肺腺癌的风险高；若fndc3b蛋白的表达水平低，则患肺癌的风险低，可用于临床肺腺癌的辅助诊断，临床应用前景良好。

附图说明

图1为免疫组化检测方法检测不同分化程度的肺腺癌组织中fndc3b的表达水平的示意图；

图2为肺腺癌组织与远端组织对照中fndc3b的蛋白表达水平westernblot检测结果图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供一种fndc3b的用途，用于制备检测肺腺癌的试剂盒。所述试剂盒包括：检测肺组织中fndc3b表达水平的试剂。所述试剂为免疫组化检测方法用试剂，也可以为westernblot或elisa检测方法用试剂。

本发明提供一种检测肺腺癌的试剂盒，包括一容器，所述容器内设有检测肺组织中fndc3b表达水平的试剂。所述试剂为免疫组化检测方法用试剂，也可以为westernblot或elisa检测方法用试剂。

本发明还提供一种肺组织中fndc3b表达水平的免疫组化检测方法，包括如下步骤：

（1）封闭过氧化物酶：取肺腺癌患者石蜡切片和远端正常肺组织石蜡切片进行脱蜡，脱蜡至水化后，用3%h2o2溶液于暗处封闭内源性过氧化物酶，室温孵育12~20min；

其中，肺腺癌患者石蜡切片和远端正常肺组织石蜡切片的脱蜡过程依次为：甲苯ⅰ10min、二甲苯ⅱ10min、无水乙醇5min、95%乙醇5min、90%乙醇5min、90%乙醇5min以及75%乙醇5min。

（2）蒸馏水漂洗：切片置于蒸馏水中，洗2~5次，每次3~8min；

（3）抗原修复：加入抗原修复液，在90~100℃水浴锅中水浴，进行抗原修复；

其中，抗原修复液为ph8.0的tris-edta或ph6.0的柠檬酸钠溶液。

（4）蒸馏水漂洗：取出切片，自然冷却至室温后，用蒸馏水洗2~5遍；

（5）孵育一抗：用免疫组化笔将组织圈住，在圈内滴加fndc3b抗体稀释液，4℃孵育过夜；

其使用的fndc3b抗体稀释液由fndc3b抗体与抗体稀释液混合配制，所述fndc3b抗体与抗体稀释液的体积比为1:200。

（6）蒸馏水漂洗：用蒸馏水洗2~5遍；

（7）滴加二抗：滴加dakohrp标记的二抗工作液，室温孵育50~70min；

（8）蒸馏水漂洗：蒸馏水2~5次，每次3~8min；

（9）dab显色：滴加显色底物dab，在显微镜下观察显色情况，于蒸馏水中终止反应；

（10）苏木素复染：将切片放入苏木素染液中染色1~3min，1%盐酸酒精分化后，流水冲洗8~15min；

（11）脱水透明：经80%、95%、100%梯度酒精脱水、二甲苯透明,于通风厨中干燥；

（12）封片：用中性快干胶封片，在光学显微镜下观察，图像采集系统采图；采图后，根据肺癌患者和远端组织的肿瘤细胞染色强度及阳性面积给予免疫组化评分。

下面以具体实施例来详述上述的肺组织中fndc3b表达水平的免疫组化检测方法。

一、实验方法

1、临床资料

选取肺腺癌患者石蜡切片276例、远端对照82例（指肺腺癌患者的远端正常肺组织石蜡切片，距离癌组织5cm），基本信息见表1。

表1临床基本信息

2、fndc3b表达水平的检测

对肺腺癌患者石蜡切片、远端组织对照石蜡切片，进行以fndc3b为指标的免疫组织化学染色（ihc）。

fndc3b抗体购自atlasantibodies，货号hpa007859。

按照如下方法检测组织中fndc3b的表达水平：

（1）封闭过氧化物酶：取石蜡切片进行脱蜡，脱蜡至水化（脱蜡过程如下：二甲苯i10min二甲苯ii10min无水乙醇5min95%乙醇5min90%乙醇5min75%乙醇5min）后，用3%h2o2溶液于暗处封闭内源性过氧化物酶，室温孵育15min；

（2）蒸馏水漂洗：切片置于蒸馏水中，洗3次，每次5min；

（3）抗原修复：加入ph8.0的tris-edta或ph6.0的柠檬酸钠溶液，在95℃水浴锅中水浴，进行抗原修复；

（4）蒸馏水漂洗：取出切片，自然冷却至室温后，用蒸馏水洗三遍；

（5）孵育一抗：用免疫组化笔将组织圈住，在圈内滴加fndc3b抗体稀释液（抗体与抗体稀释液混合配制，二者比例为1:200），4℃孵育过夜；

（6）蒸馏水漂洗：用蒸馏水洗三遍；

（7）滴加二抗：滴加dakohrp标记的二抗工作液，室温孵育60min；

（8）蒸馏水漂洗：蒸馏水3次，每次5min；

（9）dab显色：滴加显色底物dab，在显微镜下观察显色情况，于蒸馏水中终止反应；

（10）苏木素复染：将切片放入苏木素染液中染色2min，1%盐酸酒精分化后,流水冲洗10min；

（11）脱水透明：经80%、95%、100%梯度酒精脱水、二甲苯透明，于通风厨中干燥；

（12）封片：用中性快干胶封片，在光学显微镜下观察，图像采集系统采图。采图后，根据肺癌患者和远端组织的肿瘤细胞染色强度及阳性面积给予免疫组化评分。

3、免疫组化评分标准：两位不同的病理科主任采用双盲方法镜检拍照，选取每张切片具有代表性的肿瘤区域，分别观察40×、200×、400×放大倍数下目的蛋白表达情况。对于阳性信号表达的统计采用以下方法：首先将细胞核和细胞膜染色强度分为四级分别为0（阴性）、1（弱）、2（中等）、3（强）；其次将每个视野阳性表达的细胞占总细胞的比率分为五级，分别为0（0%）、1（1~25%）、2（26~50%）、3（51~75%）、4（76~100%）。每个患者最终评分为两项评分之积，且大于等于6者被认为是目的蛋白高表达。

4、结果分析：采用spss17.0对癌组织组和远端组织对照组进行统计学分析。

二、实验结果

不同分化程度的肺腺癌组织中fndc3b的表达水平见图1，其中a1表示高分化程度，a2表示中分化程度；a3表示低分化程度。

由图1示，fndc3b的表达水平与肺腺癌的分化程度密切相关，肺腺癌分化程度越低，fndc3b的表达水平越高。

肺腺癌组织与远端组织对照中fndc3b的表达水平检测结果见表2。

表2fndc3b的表达水平

由表2可见，远端正常组织中fndc3b高度阳性表达率为15.9%，肺腺癌组织中的fndc3b高度阳性表达率为77.2%。fndc3b在肺腺癌组织中显著升高，与远端正常组织相比，fndc3b表达水平差异具有统计学意义（p＜0.001）。

由以上结果可以看出，与癌旁正常肺组织相比，肺腺癌组织的fndc3b表达水平显著升高，说明肺腺癌与fndc3b表达水平呈正相关，fndc3b的高表达会显著提高患肺腺癌的可能性。由于癌旁正常肺组织的fndc3b水平可反映正常人肺组织的fndc3b水平，因此，可以通过检测待检者的fndc3b的表达水平，将肺腺癌的易感人群筛查出来。

下面以具体实施例来详述上述的肺组织中fndc3b表达水平的westernblot检测方法。

1、fndc3b蛋白表达水平的检测

对20对肺腺癌患者新鲜冰冻组织、远端组织对照，进行以fndc3b为指标的westernblot检测。

fndc3b抗体购自atlasantibodies，货号hpa007859。

1、按照如下方法检测肺组织中fndc3b的蛋白表达水平：

（1）组织总蛋白提取：将收集的新鲜冰冻组织中加入组织蛋白裂解液及

蛋白酶抑制剂进行研磨提取总蛋白，收集蛋白裂解液。以上均于冰浴中进行。4℃离心12000rpm，5min，吸出上清，即为所提的总蛋白。

（2）采用bca法测定总蛋白浓度。按上海申能博彩生物科技有限公司试剂盒说明操作。

①按每次反应使用200μlsolutiona、4μlsolutionb准备a+b混合液：solutiona、solutionb按50：1混匀后使用。每次测定要做2-3个平行反应，即每个样品需要0.6mlsolutiona和0.012mlsolutionb；

②样品用ddh2o缓冲配置，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每次实验准备3个平行测定。标准曲线取5个点，根据样品的浓度确定各点的具体浓度。用ddh2o稀释bsa；

③在96孔板中分别加入样品，然后加入200μla+b混合液，混合30sec；

④盖上盖子，37℃保温30min；

⑤冷却到室温，测定562nm的光吸收；

⑥根据标准品绘制标准曲线，得出未知样品实际蛋白浓度。

（3）westernblot分析，具体步骤如下：

①上样：取出预先配制12%聚丙烯酰胺凝胶，用上样缓冲液（1×loadingbuffer）将各组蛋白浓度调整为1μg/μl，各组蛋白取20μl，煮沸5min，进行sds-page，设置电泳模式（上层胶电压60v，40min；分离胶电压110v，100min）。

②转膜：电泳结束后，切下所需分子量大小的凝胶，pdvf膜用甲醇激活1-2min，将二者放入转膜湿转液中浸泡10-15min，采用bio-rad转膜仪恒压100v，2h将蛋白转至pdvf膜。

③牛奶包被：转膜结束后，用tbs洗涤pdvf膜2遍，每遍5min，放入5%tbs配制的牛奶中室温包被90min。

④一抗包被：根据pdvf膜的大小滴加适量的一抗fndc3b抗体稀释液（抗体与抗体稀释液混合配制，二者比例为1:1000)，放入冰箱4℃过夜。

⑤二抗包被：tbs-t洗涤3遍，每遍10min，加入适量相应的二抗，室温孵育60min，以上在避光下进行。

⑥扫膜：pbs洗涤3遍，每遍10min，将pdvf膜倒扣在odyssey扫描仪上扫描，根据灰度值，以β-actin为内参进行统计学分析。

2、结果分析

采用spss17.0统计分析软件，对癌组织组和远端组织对照组进行统计学分析，定量分析数据以均数±标准误（means±sem）表示，组间比较采取单因素方差分析，p﹤0.05表示差异有统计学意义。

3、实验结果

肺腺癌组织与远端组织对照中fndc3b的蛋白表达水平检测结果见图2。

由图2可见，肺腺癌组织中的fndc3b蛋白表达量是远端正常组织的1.7倍，fndc3b蛋白表达水平差异具有统计学意义（p＜0.01）。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。