本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种依鲁替尼对映异构体的检测方法。
背景技术：
慢性淋巴细胞白血病（chroniclymphocyticleukemia，cll）是因形态成熟的淋巴细胞不能够正常凋亡，反而在淋巴组织中克隆性增殖而引起的一种慢性血液系统恶性肿瘤。cll有一定的家族遗传性，属于b细胞非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma，nhl)中较常见的一种。套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma，mcl)是一种罕见的b细胞nhl，约占全部nhl的5%-10%，兼具恶性淋巴瘤的难治愈性及侵袭性。mcl不易诊断，约85%的患者确诊时已处于ⅲ～ⅳ期；且易复发，是远期生存率最低的亚型淋巴瘤。临床上常表现为高热乏力、脾脏和淋巴结肿大、胃肠道累及和对神经系统的浸润。目前cll的一线治疗方案是fcr方案，即氟达拉滨（f）、环磷酰胺（c）和利妥昔单抗（r）三者联合治疗的方案，该方案有一定疗效，但无疾病进展生存率为38%，3或4级不良反应时有发生。mcl常选用蒽环类或含大剂量阿糖胞苷的药物，然而对常规化疗药大多不敏感，虽然已有较多药物用于治疗，但患者的总生存期并没有明显延长；尽管也采用药物与单抗联合化疗的方案治疗mcl，但毒性较大，感染发生率约为14%，3～4级不良反应发生率高达87%。因此，可行的治疗方案和高效安全的药物有待推出。
由pharmacyclics公司和杨森制药（jassen）共同研制的依鲁替尼（ibrutinib，商品名imbruvica）作为口服的布鲁顿酪氨酸激酶（btk）抑制剂类首创新药，于2013年2月被fda授予突破性治疗药物资格，并分别于2013年11月13日和2014年2月12日批准为mcl和cll的治疗药物。依鲁替尼的化学名称为1-[(3r)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮，其结构式如下所示：
依鲁替尼对映异构体与依鲁替尼呈镜像对称，其化学名称为1-[(3s)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮。
由于依鲁替尼是单一对映体，控制其原料药中的杂质含量特别是其对映异构体的含量对于降低其不良反应具有重要的意义。专利cn104407067a公开了一种对依鲁替尼及其异构体进行hplc检测的方法，但该方法存在一些弊端，如①运行时间较长，单针运行时间35min以上；②未列出异构体杂质的计算方法，也未进行方法学验证；③未进行异构体的检测限和定量限的确定，异构体杂质在依鲁替尼原料药中的百分比（即ee值）也未知。由此可见，现有技术的检测结果并不能真实反应药物中异构体杂质的含量。基于此，本发明提供一种依鲁替尼对映异构体检测方法及其质量控制标准。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种依鲁替尼对映异构体的检测方法，其具有较高的准确度、精密度，耐用性强，可准确反映依鲁替尼原料药中对映异构体的含量，从而可为质量标准的制定提供合理的依据，以便能够更好的控制和掌握产品质量，并提高临床用药的安全性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种依鲁替尼对映异构体的检测方法，其包括如下步骤：
1）系统适用性试验溶液的制备：以甲醇为溶剂，将依鲁替尼对映异构体对照品配制成浓度为0.5mg/ml的异构体储备溶液；另取依鲁替尼对照品，按照质量体积比5:1（w/v）加入所配制的异构体储备溶液，再加甲醇溶解至溶液中依鲁替尼的浓度为0.5mg/ml，作为系统适用性试验溶液；
2）对映异构体对照品溶液的制备：以甲醇为溶剂，将依鲁替尼对映异构体对照品配制成浓度为0.25mg/ml的异构体母液；然后精密量取该异构体母液，以甲醇为溶剂，按体积比1:100进行稀释，将稀释后的溶液作为对映异构体对照品溶液；
3）供试品溶液的制备：精密称取依鲁替尼待测样品，以甲醇为溶剂配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液；
4）色谱条件与系统适用性试验：采用菲罗门手性柱（luxcellulose-4，规格250×4.6mm）；以正己烷-丙二醇-二乙胺（90:10:0.1，v/v/v）为流动相，流量1.2ml/min；检测波长为260nm；取步骤1）制备的系统适用性试验溶液进行系统适用性试验，依鲁替尼与依鲁替尼对映异构体的分离度应>5.0，理论塔板数按依鲁替尼峰计应不低于5000；
5）依鲁替尼对映异构体测定：取步骤2）所制备的对映异构体对照品溶液及步骤3）所制备的供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。
本发明还提供了一种依鲁替尼对映异构体的质量控制标准，其中依鲁替尼对映异构体的含量测定按上述检测方法进行，所测得依鲁替尼对映异构体的含量不得超过0.5％。若为更加严格的控制产品质量，保证用药安全性，该对映异构体检查的标准可提高为不得过0.1％。
本发明检测方法具有较高的准确度、精密度，耐用性强，可以准确反映依鲁替尼原料药中对映异构体的含量，适合工业上用于依鲁替尼对映异构体的检查及质量控制，可以为质量标准的制定提供合理的依据，以便能够更好的控制和掌握产品质量，并有利于提高临床用药的安全性。
附图说明
图1为依鲁替尼与其对映异构体的分离度色谱图，其中tr6.426min的为依鲁替尼的对映异构体，tr8.233min的为依鲁替尼。检测器a通道1的检测波长为260nm。
具体实施方式
依鲁替尼对映异构体的检测方法的具体步骤如下：
1）系统适用性试验溶液的制备：精密称取依鲁替尼对映异构体对照品25mg，将其置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为异构体储备溶液；另精密称取依鲁替尼对照品25mg，置于50ml容量瓶中，然后加入配制好的异构体储备溶液5ml，再加甲醇溶解并稀释至刻度，作为系统适用性试验溶液；
2）对映异构体对照品溶液的制备：精密称取依鲁替尼对映异构体对照品25mg，将其置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得异构体母液；精密量取1ml所得异构体母液，置于100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对映异构体对照品溶液；
3）供试品溶液的制备：精密称取依鲁替尼待测样品25mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
4）色谱条件与系统适用性试验：采用luxcellulose-4手性柱（250×4.6mm）；以正己烷-丙二醇-二乙胺（90:10:0.1，v/v/v）为流动相，流量1.2ml/min；检测波长为260nm；取步骤1）制备的系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，依鲁替尼与依鲁替尼对映异构体的分离度应>5，理论塔板数按依鲁替尼峰计应不低于5000；
5）依鲁替尼对映异构体测定：取步骤2）制备的对映异构体对照品溶液及步骤3）制备的供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液图谱中如显与对照品溶液图谱中对映异构体峰相应保留时间的峰，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。
所用依鲁替尼对映异构体对照品按以下方法合成：
其具体步骤如下：
1）在氮气保护下，将ph3p（58.0g，224mmol）、(r)-1-叔丁氧基羰基-3羟基哌啶（36.0g，179mmol）溶于300ml四氢呋喃中，冷却至0℃，然后在20-30min内加入diad（50.0g，250mmol）的四氢呋喃溶液80ml，搅拌10min，再于0~5℃下加入4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶（56.0g，184mmol）的四氢呋喃溶液300ml，于室温下搅拌5h，然后加水100ml进行萃取，分除水层，将有机层经无水na2so4干燥后浓缩，再经柱层析分离，真空干燥，得到(3s)-4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1-(1-叔丁氧基羰基哌啶)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶的白色固体53.2g；
2）在1l的反应瓶中加入步骤1）制得的(3s)-4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1-(1-叔丁氧基羰基哌啶)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶（42.8g，100mmol），搅拌溶于500ml甲醇中，然后在室温下缓慢加入12m盐酸溶液30ml，搅拌5h，有大量固体析出，再以6mnaoh溶液60ml中和，抽滤，所得固体用乙酸乙酯洗涤3次，干燥，得到(s)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(3-哌啶基)-1h-吡唑并[3,4-d]吡啶-4-胺30.9g；
3）在2l的反应瓶中加入1l二氯甲烷，然后加入(s)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(3-哌啶基)-1h-吡唑并[3,4-d]吡啶-4-胺（32.8g，100mmol）和丙烯酰氯（11.1g，125mmol），在25-35℃下，滴加三乙胺（13.1g，130mmol），搅拌反应4h，然后用二氯甲烷萃取，浓缩，所得粗产品加入异丙醇240ml进行重结晶，得1-[(3s)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮的白色固体34.4g，其相关数据如下：
mp：155.0~157.5℃。ms(esi+,m/z)：903[m+1]＋。
1hnmr(500mhz,300k,dmso)：δ8.39(s，1h)，δ3.6(s，2h)，δ7.44(d，1h)，δ6.98(d，1h)，δ6.98（d，1h)，δ7.44(d，1h)，δ6.92(d，1h)，δ7.22(d，1h)，δ6.98(d，1h)，δ7.22(d，1h)，δ6.92(d，1h)，δ3.40(m，1h)，δ3.70(d，2h)，δ1.5(m，2h)，δ1.8(t，2h)，δ3.0(t，2h)，δ6.62(m，1h)，δ6.12(m，1h)，δ5.50(m，1h)。
13cnmr(125mhz，dmso)：δ157.1（s），δ131.4（s），δ97.5（s），δ167.7（s），δ155.5（s），δ129.6（s），δ126.7（t），δ117.8（t），δ156.1（s），δ117.8（t），δ126.7（t），δ156.1（s），δ117.3（t），δ128.2（t），δ121.6（s），δ128.2（t），δ117.3（t），δ55.9（d），δ27.3（d），δ20.3（d），δ46.2（d），δ47.6（d），δ168.3（s），δ130.8（d），δ129.1（t）。
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实验例1流动相的选择
表1依鲁替尼对映异构体检测中色谱条件的选择
由表1可见，当流动相为正己烷-乙醇-二乙胺(90:10:0.1，v/v/v)时，所获的得hplc图谱中主峰峰型好，保留时间合适，且主峰与杂质峰的分离达到了较好的效果。因此，将正己烷-乙醇-二乙胺(90:10:0.1，v/v/v)确定为依鲁替尼对映异构体检测的流动相条件。
实验例2检测波长的选择
取依鲁替尼及依鲁替尼对映异构体对照品适量，分别用甲醇溶解并稀释成浓度约为10μg/ml的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版)，分别在200～400nm波长范围内扫描。扫描结果发现，依鲁替尼及其对映异构体在259nm波长处有最大吸收，因此，取整选择260nm为依鲁替尼对映异构体检测的检测波长。
实施例3方法学考察
1.方法专属性试验
分离度试验：取依鲁替尼与其对映异构体对照品适量，分别用乙醇配成一定浓度的溶液，在选定色谱条件下进样10μl，记录色谱图；再配制两者的混合溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱图，所得色谱图如图1所示。
由图1结果可见，依鲁替尼峰与其对映异构体峰的分离度为5.6，分离度良好。
2.准确度试验
取依鲁替尼对映异构体对照品约25mg，精密称定，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密移取1.0ml置于100ml量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀，作为异构体浓溶液；称取依鲁替尼原料约25mg共三份，精密称定，分别置于三个50ml量瓶中，并分别加入上述异构体浓溶液4ml、5ml和6ml，以制成80％、100％和120％的三个浓度点，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为回收率测定供试品溶液。每个浓度点另平行三份。
分别取上述供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，据测得量和实际加入量计算回收率。试验结果见表2。
表2依鲁替尼对映异构体准确度试验
由表2结果可见，该方法准确度良好，符合测试要求。
3.精密度试验
3.1重复性试验
取依鲁替尼对映异构体对照品约25mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密移取1.0ml置于100ml容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，作为异构体浓溶液；取依鲁替尼样品约25mg，共6份，精密称定，分别置于6个50ml容量瓶中，并分别加入上述异构体浓溶液5ml，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。
另精密称取依鲁替尼对映异构体对照品25mg，置于100ml容量瓶中，精密移取1ml至100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为对映异构体对照品溶液。
精密量取6份供试品溶液和对映异构体对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图。试验结果显示，6个样品中对映异构体的含量分别为（%）0.49、0.48、0.49、0.47、0.50、0.48，6次测量结果的rsd％为1.46％，证明该方法具有一定的精密度。
3.2系统精密度
取依鲁替尼对映异构体对照品25mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，精密移取1.0ml该溶液置100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为2.5μg/ml的溶液，连续进样5次，每次10μl，记录峰面积，并对结果进行评价，试验结果见表3。
表3系统精密度试验结果
由表3可见，该方法系统精密度良好，符合测试要求。
4.线性与范围
取依鲁替尼对映异构体对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并依次稀释，制成浓度范围为0.05μg/ml～10.02μg/ml的系列标准溶液。依色谱条件，分别精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度c(μg/ml)为横坐标，峰面积a为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程和相关系数，结果见表4。
表4依鲁替尼对映异构体线性与范围试验结果
表4结果表明，在0.05μg/ml～10.02μg/ml的范围内，依鲁替尼对映异构体的线性关系良好。
5.定量限和检测限
调节仪器灵敏度，用甲醇配制成一定浓度的依鲁替尼对映异构体溶液，逐步稀释后进样10μl，使主峰高为基线噪音的2-3倍，记录色谱图，得依鲁替尼对映异构体的最小检测限为0.3ng。
调节仪器灵敏度，用甲醇配制成一定浓度的依鲁替尼对映异构体溶液，逐步稀释后进样10μl，使主峰高为基线噪音的10倍左右，记录色谱图，得依鲁替尼对映异构体的最小定量限为1.0ng。
6.溶液稳定性试验
6.1依鲁替尼对映异构体标准溶液稳定性试验
取依鲁替尼异构体对照品约25mg，精密称定，置于100ml容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密移取1ml该溶液到100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，作为标准溶液。分别于0、2、4、8、16、24小时吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果见表5。
表5标准溶液稳定性
由表5可见，依鲁替尼对映异构体的甲醇溶液室温放置24小时稳定性良好。
6.2依鲁替尼供试品溶液稳定性试验
称取依鲁替尼原料约25mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度约为0.5mg/ml的供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24小时吸取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果见表6。
表6依鲁替尼供试品溶液稳定性
由表6可见，依鲁替尼供试品的甲醇溶液室温放置24小时稳定性良好。
7.耐用性试验
通过改变流动相比例、流速来评估测定条件微小变动时，测定结果不受影响的承受程度。在每个条件下，分别取依鲁替尼及其对映异构体对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成每ml中含依鲁替尼0.5mg和异构体2.5μg的溶液，作为供试品溶液；另取异构体杂质对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含2.5μg的溶液作为异构体对照品溶液，分别精密量取异构体对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，对结果进行评价。结果证明，本方法耐用性良好，符合测试要求。
实施例4依鲁替尼对映异构体的检测及其质量检查
1）系统适用性试验溶液的制备：取依鲁替尼对映异构体对照品25mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为异构体储备溶液；另取依鲁替尼对照品25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加入异构体储备液5ml，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为系统适用性溶液；
2）对映异构体对照品溶液的制备：取依鲁替尼对映异构体对照品25mg，精密称定，置于100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置于100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对映异构体对照品溶液；
3）供试品溶液的制备：取依鲁替尼待测样品25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
4）色谱条件与系统适用性试验：采用luxcellulose-4手性柱（250×4.6mm），以正己烷-丙二醇-二乙胺（90:10:0.1，v/v/v）为流动相，流量1.2ml/min，检测波长为260nm；取步骤1）制备的系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，依鲁替尼与依鲁替尼对映异构体的分离度应>5.0，理论塔板数按依鲁替尼峰计应不低于5000；
5）依鲁替尼对映异构体测定：取步骤2）制备的对映异构体对照品溶液及步骤3）制备的供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液图谱中如显与对照溶液图谱中对映异构体峰相应保留时间的峰，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。
使用上述检测方法对三批样品中对映异构体含量进行检测，并进行稳定性试验，结果分别见表7、表8。
表7依鲁替尼样品中对映异构体的检查结果
表8依鲁替尼稳定性样品中对映异构体的检查结果
由试验结果可见，经过加速及长期稳定性试验，各批次样品中均未检出对映异构体，为更加严格的控制产品质量，保证用药安全，可将对映异构体检查的标准提高为不得过0.1％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。