一种检测大气颗粒物致眼损伤的方法与流程

文档序号:11771794阅读:571来源:国知局

本发明属于医疗卫生及生物技术领域,具体为一种检测大气颗粒物致眼损伤的方法。



背景技术:

空气污染已成为世界许多地区一个重要的公共卫生问题。越来越多的流行病学和临床证据表明,污染物使人群各种疾病的患病率增加。大气颗粒物(particularmatter,pm)是不同大小和化学特征的液体和固体材料的混合物,包括释放到空气中的烟尘、烟雾、灰尘、污垢等。颗粒物依据其动力学直径,将空气动力学直径≤2.5μm的固体颗粒物称为pm2.5,pm2.5是各种气体的混合物和颗粒组件,主要由含碳物质、有机质、元素碳的总和、有机物组成。目前认为pm2.5主要是人为燃烧排放等过程而产生,是雾霾的主要成分,可能对人体健康产生负面影响,因此对于pm2.5的监测和研究极为重要。眼球作为机体的一个重要器官,眼表直接暴露于外界,颗粒物pm2.5是否对眼表产生影响?目前,大部分的研究都是对于肺部、鼻部,而对于眼镜,还没有建立良好的、能够标准化、规模化,易于推向市场的检测方法。



技术实现要素:

为解决上诉技术问题,本发明提供了一种能够检测出大气颗粒物对眼睛是否有影响的方法,方便、快捷,可为临床防治提供理论基础。

为了实现上述目的,本发明公开的技术方案为:本发明公开的检测大气颗粒物致眼损伤的方法,包括如下步骤,(1)采用四通道大气颗粒物智能采样仪,切割出大气颗粒物,采用聚四氟乙烯滤膜包覆大气颗粒物,将包覆有滤膜的大气颗粒物浸入蒸馏水中,超声振荡后用纱布滤过,干燥后备用;

(2)取步骤(1)备用的大气颗粒物,将大气颗粒物稀释于无菌的pbs中得到大气颗粒物滴眼液,再向大气颗粒物加入苯扎溴铵,保存于4℃冰箱备用;

(3)取体外眼角膜组织细胞,向体外培养角膜组织细胞滴入步骤(2)配置出的滴眼液设置成试验组,并设置空白对照组,将试验组和空白对照组采用荧光素染色、苏木精、伊红染色后,观察体外培养角膜组织细胞损伤情况。

最贴合现实的模拟自然环境,采用最贴合人体眼睛环境的体外培养角膜组织细胞为试验对象,最大化与实际情况相符,采用四氟乙烯滤膜包覆大气颗粒物、与pbs溶解、加入苯扎溴铵可以很容易的均匀分散,更容易的形成匀质的滴眼液,有助于后续滴加进体外培养角膜组织细胞中,使实验组、空白对照组均匀度一致,无其他菌落,去除影响检测的干扰。

进一步的,所述步骤(3)中使用浓度为10g·l-1荧光素钠溶液分别滴入1μl至试验组和空白对照组的体外培养角膜组织细胞中,使荧光素钠溶液均匀分布于体外培养角膜组织细胞表面,在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察记录角膜染色区出现的破裂情况。荧光素钠本身没有对体外培养角膜组织细胞有损伤作用,采用它对体外培养角膜组织细胞染色,可以良好的观察出体外眼角膜组织细胞的损伤情况。

进一步的,所述步骤(3)中分别将试验组、空白对照组的体外培养角膜组织细胞用质量浓度为4%多聚甲醛溶液固定,然后经石蜡包埋、切片处理,采用苏木精-伊红染色,置入显微镜下观察角膜损伤情况。所述固定是制作标本常用的方法,即就是向材料体内注射部分固定夜,再浸渍固定液,本发明选用4%多聚甲醛溶液作为固定液,可快速杀死细胞,使细胞最大化保持原有自然状态、不皱缩、不膨胀,同时,一方面使组织硬化便于截切,而且增加内含物折光度,使某些体外眼角膜组织细胞便于着色、观察。

进一步的,该方法还包括步骤(4),将试验组、空白对照组的体外培养角膜组织细胞分别经质量浓度为2.5%戊二醛溶液前固定2小时,质量浓度为1%锇酸溶液后固定1小时,再分别经真空冷冻干燥、乙醇梯度脱水,包埋,经枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重染色后于场发射扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察角膜上皮细胞超微结构。采用所述方法对体外培养角膜组织细胞进一步观察,可从多方面、多角度,更综合、真实的检测出大气颗粒物对体外培养角膜组织细胞的损伤情况。

进一步的,所述步骤(1)中对大气颗粒物切割的粒径为2.5-10μm,将包覆有大气颗粒物的四氟乙烯滤膜裁剪为1cm×1cm,超声振荡45min,经真空条件下冷冻干燥,再于4℃保存备用。所切割的粒径为自然环境条件下最常见的颗粒物,经振荡后,使颗粒物更好的与四氟乙烯滤膜相包覆。

进一步的,所述步骤(2)中大气颗粒物稀释于无菌pbs中得到大气颗粒物滴眼液的浓度为5-10mg/ml,滴加滴眼液的次数为3次,在向大气颗粒物加入苯扎溴铵时,苯扎溴铵的添加量为0.005-0.1g。所选择的滴眼液的浓度、次数等均可最大化贴近真实情况,对平均试验多次结果准确性的不良影响最小。

本发明的积极进步效果在于:设计出了一种最大化贴合实际情况、得到一种干扰因素少、能够检测出大气颗粒物致眼损伤的方法,对临床治疗给出了准确的理论依据,所使用的材料毒副作用小,对环境友好,安全、方便、快捷。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。

实施例一:本发明公开的一种检测大气颗粒物致眼损伤的方法,包括如下步骤,(1)采用四通道大气颗粒物智能采样仪,切割出大气颗粒物,采用聚四氟乙烯滤膜包覆大气颗粒物,将包覆有滤膜的大气颗粒物浸入蒸馏水中,超声振荡后用纱布滤过,干燥后备用;

(2)取步骤(1)备用的大气颗粒物,将大气颗粒物稀释于无菌的pbs中得到大气颗粒物滴眼液,再向大气颗粒物加入苯扎溴铵,保存于4℃冰箱备用;

(3)取体外培养角膜组织细胞,向体外培养角膜组织细胞滴入步骤(2)配置出的滴眼液设置成试验组,并设置空白对照组,将试验组和空白对照组采用荧光素染色、苏木精-伊红染色后,观察体外培养角膜组织细胞损伤情况。

采用本发明方法可以检测得到大气颗粒物对体外培养角膜组织细胞的损害,进而为临床医疗提供理论基础。

以下是通过此方法得到的结果,1、空白对照为a组,滴加大气颗粒物滴眼液的为b组,a、b两组内干预前和干预1d、4d后fl相比较,差异无统计学意义(t=0.341,t=0.512,t=0.835,p均>0.05),两组间干预前和干预fl相比较,差异无统计学意义(t=0.000,t=0.469,t=0.573,p均>0.05);干预7d后,a组fl较干预前无明显变化,差异无统计学意义(t=0.781,p均>0.05),而b组fl较干预前明显恶化,差异有统计学意义(t=7.432,p均<0.05);两组fl相比,差异有统计学意义(t=5.893,p<0.05,详见表1)。

表1各组体外培养角膜组织细胞干预前和干预后各时段荧光素染色评分情况比较(x±s)

注:*p<0.05

1、角膜fl情况

角膜荧光染色显示,a组体外培养角膜组织细胞采用pbs滴眼液滴眼7d后角膜染色无明显变化,b组体外培养角膜组织细胞采用大气颗粒物滴眼液滴眼7d后整个角膜荧光素染色区域明显增加,呈点片状着染。

2、角膜he染色(苏木精-伊红)情况和穹隆部结膜pas染色结果:pbs滴眼液滴眼7d后角膜上皮由整齐排列的4~6层上皮细胞组成,基底细胞为一单层柱状上皮细胞层,排列紧密整齐。角膜上皮层数未见增加,基底细胞仍为一单层柱状上皮细胞层,角膜上皮厚度基本没有改变,表层上皮较为完整,而经过大气颗粒物滴眼液滴眼7d后角膜上皮细胞层数开始增多,上皮厚度增加,翼状细胞及基底细胞排列紊乱,同时伴有表层上皮细胞损伤、脱落,角膜表面欠光滑。干预7d后,b组上皮细胞层数为(4±1)层,而a组上皮细胞层数为(7±1)层,两组比较,差异有统计学意义(t=8.614,p<0.05)。a组结膜上穹窿部包含多层上皮细胞,细胞形态呈圆柱状或骰状,杯状细胞广泛分布于穹窿部上皮细胞之间,杯状细胞计数为15±1。b组结膜上穹窿部上皮细胞排列紊乱,出现缺失,杯状细胞形态不一致,数量减少,计数为6±2,出现显著性差异。

实施例二:本发明公开的一种检测大气颗粒物致眼损伤的方法,包括如下步骤,(1)采用四通道大气颗粒物智能采样仪,切割出大气颗粒物,采用聚四氟乙烯滤膜包覆大气颗粒物,将包覆有滤膜的大气颗粒物浸入蒸馏水中,超声振荡后用纱布滤过,干燥后备用;

(2)取步骤(1)备用的大气颗粒物,将大气颗粒物稀释于无菌的pbs中得到大气颗粒物滴眼液,再向大气颗粒物加入苯扎溴铵,保存于4℃冰箱备用;

(3)取体外培养角膜组织细胞,向体外培养角膜组织细胞滴入步骤(2)配置出的滴眼液设置成试验组,并设置空白对照组,分别将试验组、空白对照组的体外培养角膜组织细胞用质量浓度为4%多聚甲醛溶液固定,然后经石蜡包埋、切片处理将试验组和空白对照组采用荧光素染色、苏木精-伊红染色后,观察体外培养角膜组织细胞损伤情况;

进一步的,使用浓度为10g·l-1荧光素钠溶液分别滴入1μl至试验组和空白对照组的体外培养角膜组织细胞中,使荧光素钠溶液均匀分布于体外培养角膜组织细胞表面,在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察记录角膜染色区出现的破裂情况。

为了多维度检测大气颗粒物致眼损伤,本发明还包括步骤(4),将试验组、空白对照组的体外培养角膜组织细胞分别经质量浓度为2.5%戊二醛溶液前固定2小时,质量浓度为1%锇酸溶液后固定1小时,再分别经真空冷冻干燥、乙醇梯度脱水,包埋,经枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重染色后于场发射扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察角膜上皮细胞超微结构。

进一步的,所述步骤(1)中对大气颗粒物切割的粒径为2.5μm,将包覆有大气颗粒物的四氟乙烯滤膜裁剪为1cm×1cm,超声振荡45min,经真空条件下冷冻干燥,再于4℃保存备用。

进一步的,所述步骤(2)中大气颗粒物稀释于无菌pbs中得到大气颗粒物滴眼液的浓度为5mg/ml,滴加滴眼液的次数为3次,在向大气颗粒物加入苯扎溴铵时,苯扎溴铵的添加量为0.005g。

步骤(4)检测得到的结果:空白对照组为a组,滴加大气颗粒物的实验组为b组,正常角膜上皮细胞会向外伸出许多微绒毛和微皱襞,排列整齐。用pbs点眼7天后,通过透射电镜下可见a组表层上皮细胞向外可见丰富的微绒毛,呈指状突起,排列规则。相比较下b组使用大气颗粒物滴眼液点眼7天后,角膜上皮微绒毛可见明显减少,微绒毛形态也与a组有很大差别,偶见指状突起,大部分微绒毛变短,而且排列也不规则,两组受试体外培养角膜组织细胞应用不同滴眼液处理7天后角膜上皮细胞微绒毛形态的比较(醋酸双氧铀,枸橼酸铅×10000):应用pbs滴眼液点眼7天后,角膜上皮微绒毛呈指状突起,微绒毛数量多,排列整齐(箭头):应用大气颗粒滴眼液点眼组7天后角膜上皮微绒毛减少、变短、排列紊乱,角膜上皮细胞剥脱。

以下列举部分试验,用以说明,本发明方法中所选择的试剂聚四氟乙烯滤膜、pbs、苯扎溴铵为最优选择,如下表所示:

实施例三:本发明公开的一种检测大气颗粒物致眼损伤的方法,包括如下步骤,(1)采用四通道大气颗粒物智能采样仪,切割出大气颗粒物,采用聚四氟乙烯滤膜包覆大气颗粒物,将包覆有滤膜的大气颗粒物浸入蒸馏水中,超声振荡后用纱布滤过,干燥后备用;

(2)取步骤(1)备用的大气颗粒物,将大气颗粒物稀释于无菌的pbs中得到大气颗粒物滴眼液,再向大气颗粒物加入苯扎溴铵,保存于4℃冰箱备用;

(3)取体外培养眼角膜细胞,向外培养眼角膜细胞滴入步骤(2)配置出的滴眼液设置成试验组,并设置空白对照组,分别将试验组、空白对照组的外培养眼角膜细胞用质量浓度为4%多聚甲醛溶液固定,然后经石蜡包埋、切片处理将试验组和空白对照组采用荧光素染色、苏木精-伊红染色后,观察外培养眼角膜细胞损伤情况;

进一步的,使用浓度为10g·l-1荧光素钠溶液分别滴入1μl至试验组和空白对照组的外培养眼角膜细胞中,使荧光素钠溶液均匀分布于外培养眼角膜细胞表面,在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察记录角膜染色区出现的破裂情况。

为了多维度检测大气颗粒物致眼损伤,本发明还包括步骤(4),将试验组、空白对照组的外培养眼角膜细胞分别经质量浓度为2.5%戊二醛溶液前固定2小时,质量浓度为1%锇酸溶液后固定1小时,再分别经真空冷冻干燥、乙醇梯度脱水,包埋,经枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重染色后于场发射扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察角膜上皮细胞超微结构。

进一步的,所述步骤(1)中对大气颗粒物切割的粒径为10μm,将包覆有大气颗粒物的四氟乙烯滤膜裁剪为1cm×1cm,超声振荡45min,经真空条件下冷冻干燥,再于4℃保存备用。

进一步的,所述步骤(2)中大气颗粒物稀释于无菌pbs中得到大气颗粒物滴眼液的浓度为10mg/ml,滴加滴眼液的次数为3次,在向大气颗粒物加入苯扎溴铵时,苯扎溴铵的添加量为0.1g。

以下采用部分试验例用以说明,本发明所选择的染色剂的选择过程:

实施例四:本发明公开的一种检测大气颗粒物致眼损伤的方法,包括如下步骤,(1)采用四通道大气颗粒物智能采样仪,切割出大气颗粒物,采用聚四氟乙烯滤膜包覆大气颗粒物,将包覆有滤膜的大气颗粒物浸入蒸馏水中,超声振荡后用纱布滤过,干燥后备用;

(2)取步骤(1)备用的大气颗粒物,将大气颗粒物稀释于无菌的pbs中得到大气颗粒物滴眼液,再向大气颗粒物加入苯扎溴铵,保存于4℃冰箱备用;

(3)取外培养眼角膜细胞,向外培养眼角膜细胞滴入步骤(2)配置出的滴眼液设置成试验组,并设置空白对照组,分别将试验组、空白对照组的外培养眼角膜细胞用质量浓度为4%多聚甲醛溶液固定,然后经石蜡包埋、切片处理将试验组和空白对照组采用荧光素染色、苏木精-伊红染色后,观察外培养眼角膜细胞损伤情况;

进一步的,使用浓度为10g·l-1荧光素钠溶液分别滴入1μl至试验组和空白对照组的外培养眼角膜细胞中,使荧光素钠溶液均匀分布于外培养眼角膜细胞表面,在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察记录角膜染色区出现的破裂情况。

为了多维度检测大气颗粒物致眼损伤,本发明还包括步骤(4),将试验组、空白对照组的外培养眼角膜细胞分别经质量浓度为2.5%戊二醛溶液前固定2小时,质量浓度为1%锇酸溶液后固定1小时,再分别经真空冷冻干燥、乙醇梯度脱水,包埋,经枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重染色后于场发射扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察角膜上皮细胞超微结构。

进一步的,所述步骤(1)中对大气颗粒物切割的粒径为5μm,将包覆有大气颗粒物的四氟乙烯滤膜裁剪为1cm×1cm,超声振荡45min,经真空条件下冷冻干燥,再于4℃保存备用。

进一步的,所述步骤(2)中大气颗粒物稀释于无菌pbs中得到大气颗粒物滴眼液的浓度为8mg/ml,滴加滴眼液的次数为3次,在向大气颗粒物加入苯扎溴铵时,苯扎溴铵的添加量为0.01g。

以下采用部分试验例用以说明,本发明步骤(3)所选择的固定液的选择过程:

以下列举部分试验例用以说明,本发明步骤(4)中所选取的固定液、染色剂的过程:

以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1