库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法与流程

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库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法与流程

本发明属于生物制品领域,具体涉及库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法。



背景技术:

库尔勒香梨属新疆梨种(pyrussinkiangensisyu),维吾尔语名乃西米提或乃西普提,原产于新疆南疆巴音郭楞蒙古自治州,阿克苏等地,至今已有1300年的栽培历史。库尔勒香梨皮薄肉脆,清甜爽口,细嫩多汁,维生素c含量丰富且耐贮藏,曾多次在国内获奖,在国际市场上被誉为“中华蜜梨”、“梨中珍品”、“果中王子”等称号。库尔勒香梨营养价值高,含糖、氨基酸、维生素、各种碳水化合物达14%,水汁为86%。其中含糖量10%,酸0.03%,灰分0.12%,每100克香梨含维生素c约4.3毫克,含有葡萄糖、果酸及多种微量元素,可食部分达83.6%。库尔勒香梨不仅可以生食,而且可以做梨酒、梨膏等相关食品,并有"润肺、凉心、消痰、消炎、止咳、解疮毒酒毒"等医疗作用,维吾尔医、蒙医中常把它作为食疗佳品。

库尔勒香梨在新疆大面积种植,在巴州库尔勒市种植面积最多,从2007年起,香梨成为库尔勒市农民增收的第一产业,并且库尔勒香梨的种植面积以每年5万亩的速度快速递增。现在,库尔勒香梨已远销美国、加拿大、澳大利亚、欧盟、东南亚等十多个国家和地区。

但近几年香梨腐烂病发生严重,病情难以控制。腐烂病亦称腐朽病(decay),果树腐烂病又称烂皮病、臭皮病等,世界各地均有发生。梨树腐烂病是梨树最重要的枝干病害,以侵染和为害主枝和较大的侧生枝组为主,在主干上也有发生。当病斑环绕整个主枝时,主枝即死亡,严重发生时可造成死树和毁园,对果农造成巨大的经济损失。

腐烂病菌毒素对库尔勒香梨具有毒害作用,但对腐烂病菌毒素的研究,可以促进香梨腐烂病的病理性研究,并且可以进一步的奠定研究香梨腐烂病治病机制及防治的基础,对研究香梨腐烂病治病机制及防治有重要理论意义。因此在研究过程中,需要病菌毒素,但是现在前人的研究只确定了引起库尔勒香梨树腐烂病菌为梨幹腐烂壳蕉孢菌(c.carphospermafr.)。目前关于库尔勒香梨腐烂病的研究主要在库尔勒香梨腐烂病病原鉴定和库尔勒香梨腐烂病菌生物学特性与致病性方面,只知库尔勒香梨树腐烂病菌的最适温区为20-30℃,最适ph值为5-7,在全光照的条件下产孢最多且菌丝最密,但是毒素含量非常低;有关库尔勒香梨腐烂病菌产毒条件研究未见报道,无法确定最适产毒培养方法。因为不同病原菌最适产毒培养条件也有所不同,例如:番茄叶霉病菌产毒最适培养条件:ph为6、温度为26-30℃、培养时间21天、黑暗条件下振荡培养;雷公藤角斑病菌产毒最适培养条件:ph为7的查氏培养液中,培养温度为29℃,黑暗条件下振荡培养25天产生的毒素致病力最强。从而香梨腐烂病菌的毒素很难快速有效的制备出来,限制了香梨腐烂病的研究。

有鉴于此,本发明提出一种库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且可以有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素。

为了实现上述目的,所采用的的技术方案为:

库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,包括以下步骤:

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到培养液中,在20-30℃下振荡培养3天以上,得培养后的菌液;

所述培养液为马铃薯葡萄糖培养液、马铃薯蔗糖培养液、查氏培养液和叶片煎汁蔗糖培养液中的一种;

(2)将培养后的菌液滤去菌丝,再过滤,得滤液;将滤液离心15-21分钟,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

进一步的,所述马铃薯葡萄糖培养液的制备:将去皮马铃薯切块,加水煮沸15-30分钟,过滤,得马铃薯滤液;向马铃薯滤液中加入葡萄糖,并且加水定容,再灭菌,得马铃薯葡萄糖培养液;其中,马铃薯的质量、葡萄糖的质量与定容后的体积比为20g:2g:95-105ml;

所述马铃薯蔗糖培养液的制备:将去皮马铃薯切块,加水煮沸15-30分钟,过滤,得马铃薯滤液;向马铃薯滤液中加入蔗糖,并且加水定容,再灭菌,得马铃薯蔗糖培养液;其中,马铃薯的质量、蔗糖的质量与定容后的体积比为20g:2g:95-105ml;

所述查氏培养液中的含氮化合物、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、蔗糖和水的质量比为2:1:0.5:0.5:0.01:30:950-1050;

所述香梨叶片煎汁蔗糖培养液的制备:将香梨叶片加水煮沸15-30分钟,过滤,得滤液;向滤液中加入蔗糖,并且加水定容,再灭菌,得香梨叶片煎汁蔗糖培养液;其中,香梨叶片的质量、蔗糖的质量与定容后的体积比为6g:2g:95-105ml。

再进一步的,所述查氏培养液中的含氮化合物为硝酸钠或酵母膏。

进一步的,所述步骤(1)中,所述培养液的ph值为6.0-8.0;

所述库尔勒香梨腐烂病菌接种后进行暗培养。

再进一步的,所述步骤(1)中,所述培养液的ph值为7.0;

所述振荡培养为连续振荡培养;

所述培养温度为25℃。

再进一步的,所述步骤(1)中,振荡的转速为100-140r/min。

再进一步的,所述步骤(1)中,振荡的转速为120r/min。

进一步的,所述步骤(2)中,离心的转速为4500-5500r/min。

再进一步的,所述步骤(2)中,离心的转速为5000r/min。

与现有技术相比,本发明的有益效果在于:

本发明所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

附图说明

图1为离体叶片针刺法培养5天后叶片的示意图;

图2为叶圆片浸渍法培养5天后滤纸的示意图;

图3为不同培养温度下库尔勒香梨腐烂病菌坏死斑直径的折线图;

图4为不同ph值下库尔勒香梨腐烂病菌坏死斑直径的折线图;

图5为不同通气量下库尔勒香梨腐烂病菌坏死斑直径的柱形图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,达到预期发明目的,以下结合较佳实施例,对依据本发明提出的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,其具体实施方式、结构、特征及其功效,详细说明如后。在下述说明中,不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外,一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件书进行。

下面将结合具体的实施例,对本发明库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法做进一步的详细介绍:

一实施例

实施例1.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为6.0的马铃薯葡萄糖培养液中,置于温度为20℃,转速为140r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养5天,得培养后的菌液;马铃薯葡萄糖培养液的制备:将200g去皮马铃薯切块,加水煮沸15分钟,过滤,得马铃薯滤液;向马铃薯滤液中加入20g葡萄糖,并且加水定容至950ml,再灭菌,得马铃薯葡萄糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为4500r/min,时间为21min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例2.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为8.0的马铃薯葡萄糖培养液中,置于温度为30℃,转速为100r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养3天,得培养后的菌液;马铃薯葡萄糖培养液的制备:将200g去皮马铃薯切块,加水煮沸30分钟,过滤,得马铃薯滤液;向马铃薯滤液中加入20g葡萄糖,并且加水定容至1050ml,再灭菌,得马铃薯葡萄糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为5500r/min,时间为15min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例3.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为7.0的马铃薯葡萄糖培养液中,置于温度为25℃,转速为120r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养4天,得培养后的菌液;马铃薯葡萄糖培养液的制备:将200g去皮马铃薯切块,加水煮沸25分钟,过滤,得马铃薯滤液;向马铃薯滤液中加入20g葡萄糖,并且加水定容至1000ml,再灭菌,得马铃薯葡萄糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为5000r/min,时间为18min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例4.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为6.0的马铃薯蔗糖培养液中,置于温度为23℃,转速为110r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养3天,得培养后的菌液;马铃薯蔗糖培养液的制备:将200g去皮马铃薯切块,加水煮沸20分钟,过滤,得马铃薯滤液;向马铃薯滤液中加入20g蔗糖,并且加水定容至950ml,再灭菌,得马铃薯蔗糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为4800r/min,时间为19min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例5.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为7.0的马铃薯蔗糖培养液中,置于温度为28℃,转速为130r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养6天,得培养后的菌液;马铃薯蔗糖培养液的制备:将200g去皮马铃薯切块,加水煮沸22分钟,过滤,得马铃薯滤液;向马铃薯滤液中加入20g蔗糖,并且加水定容至1000ml,再灭菌,得马铃薯蔗糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为5100r/min,时间为18min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例6.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为8.0的马铃薯蔗糖培养液中,置于温度为26℃,转速为125r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养4天,得培养后的菌液;马铃薯蔗糖培养液的制备:将200g去皮马铃薯切块,加水煮沸28分钟,过滤,得马铃薯滤液;向马铃薯滤液中加入20g蔗糖,并且加水定容至1050ml,再灭菌,得马铃薯蔗糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为5000r/min,时间为20min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例7.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为7.0的查氏培养液中,置于温度为25℃,转速为120r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养4天,得培养后的菌液;查氏培养液中含有硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g和水950g。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为4500r/min,时间为21min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例8.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为7.0的查氏培养液中,置于温度为23℃,转速为130r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养5天,得培养后的菌液;查氏培养液中含有酵母膏2g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g和水1050g。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为5500r/min,时间为15min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例9.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为7.2的查氏培养液中,置于温度为30℃,转速为110r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养3天,得培养后的菌液;查氏培养液中含有硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g和水1000g。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为5200r/min,时间为17min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对腐烂病菌毒素的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例10.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为6.8的香梨叶片煎汁蔗糖培养液中,置于温度为29℃,转速为115r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养3天,得培养后的菌液;香梨叶片煎汁蔗糖培养液的制备:将60g的香梨叶片加水煮沸15分钟,过滤,得香梨叶片滤液;向香梨叶片滤液中加入20g蔗糖,并且加水定容至950ml,再灭菌,得香梨叶片煎汁蔗糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为4700r/min,时间为20min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例11.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为7.5的香梨叶片煎汁蔗糖培养液中,置于温度为26℃,转速为120r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养5天,得培养后的菌液;香梨叶片煎汁蔗糖培养液:将60g的香梨叶片加水煮沸30分钟,过滤,得香梨叶片滤液;向香梨叶片滤液中加入20g蔗糖,并且加水定容至1050ml,再灭菌,得香梨叶片煎汁蔗糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为5200r/min,时间为16min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

实施例12.

(1)将活化后的库尔勒香梨腐烂病菌接种到ph值为6.5的香梨叶片煎汁蔗糖培养液中,置于温度为25℃,转速为120r/min的摇床中,在全黑暗条件下连续振荡培养4天,得培养后的菌液;香梨叶片煎汁蔗糖培养液:将60g的香梨叶片加水煮沸25分钟,过滤,得香梨叶片滤液;向香梨叶片滤液中加入20g蔗糖,并且加水定容至1000ml,再灭菌,得香梨叶片煎汁蔗糖培养液。

(2)将培养后的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,得滤液;滤液用离心机离心,转速为5000r/min,时间为19min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液,收集上清液;将上清液萃取,浓缩,得到香梨腐烂病菌毒素。

本发明实施例所述的库尔勒香梨腐烂病菌毒素的制备方法,该制备方法简单,并且在最适产毒条件下培养库尔勒香梨腐烂病菌,可以快速有效的制备出库尔勒香梨腐烂病菌毒素,促进对香梨腐烂病的研究,从而促进香梨腐烂病的病理性研究,还可以促进对香梨腐烂病的防治。

二实验测试

1材料与方法

1.1供试菌株

在阿拉尔3个不同梨园中采集带有香梨腐烂病菌的树皮,经柯赫氏法则验证后获得纯培养备用。对所选菌株进行编号,分别为菌种xl-1、菌种xl-2和菌种xl-3,供试菌株形态特征如表1所示。

表1供试菌株形态特征

1.2病菌粗毒素滤液的提取与制备

(1)腐烂病菌的活化:将腐烂病菌接到pda培养基上,25℃下培养5天。

(2)病菌粗毒素滤液的提取与制备:用直径6mm的圆形打孔器在长势均匀的菌落边缘打取菌饼,接种到盛有150ml培养液的三角瓶中,每瓶接5个菌饼。置于温度为25℃,转速为120r/min的摇床中暗培养5天。将培养的菌液先用双层纱布滤去菌丝,再用含有双层滤纸的漏斗过滤,滤液于离心机5000r/min,18min,上清液即为无菌丝的粗毒素滤液。

1.3生物活性测定

1.3.1离体叶片针刺法:取相同部位的成熟叶片,用清水洗净,经70%的酒精中浸泡3秒,再用无菌水漂洗3次,用灭菌的滤纸吸干叶面水分;在叶面上针刺造成轻微伤口(避开叶脉),每次吸取20ul粗毒素滤液于针刺部位,设3次重复,以灭菌纯水对照。处理后叶片置于25℃培养箱中培养,5天后测量菌斑大小并记录,如图1所示。

1.3.2叶圆片浸渍法:分别吸取2ml不同条件的毒素溶液于培养皿中(含滤纸)。取香梨一定部位的叶片,用清水清洗净然,经70%的酒精中浸泡3秒,再用无菌水漂洗3次,用灭菌的滤纸吸干叶面水分;用圆形打孔器(ф=8cm)打取圆片,腹面向下平放在加有2ml粗毒素滤液的培养皿中的滤纸上,每皿6片。设3次重复,以灭菌纯水对照。处理后叶片置于25℃培养箱中培养,连续观察5天并记录,如图2所示。

2.1不同培养条件的试验设计

2.1.1不同培养液产毒能力的测定

试验选用5中培养液,分别为:

(1)马铃薯葡萄糖培养液(简称pd培养液):马铃薯200g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml。(即实施例3制备的培养液)

(2)马铃薯蔗糖培养液(简称ps培养液):马铃薯200g,蔗糖20g,蒸馏水1000ml。(即实施例5制备的培养液)

(3)czapek培养液(又名查氏培养液):nan032g,k2hp041g,kc10.5g,0.5g的mgso4·7h20,0.01g的feso4,蔗糖30g,蒸馏水1000g。(即实施例9制备的培养液)

(4)香梨叶片煎汁蔗糖培养液:香梨叶片60g,蔗糖20g,蒸馏水1000ml。(即实施例12制备的培养液)

(5)香梨叶片煎汁马铃薯培养液:香梨叶片60g,马铃薯200g,蒸馏水1000ml。

将三种香梨腐烂病菌菌饼分别接入上述5种培养液,各培养液ph值为7。在25℃、光照、转速为120r/min的振荡条件下培养5天。所有处理均按照1.3的方法提取含毒滤液,1.4的方法进行生物活性测定。测定菌斑直径,观察褪绿斑面积大小。

2.1.2不同培养时间对产毒能力的影响

将菌饼接入pd培养液中,在25℃、光照、转速为120r/min的振荡条件下分别培养1、3、5、7、9天后,测定其产毒量。所有处理均按照1.3的方法提取含毒滤液,1.4的方法进行生物活性测定。测定菌斑直径,观察褪绿斑面积大小。

2.1.3不同培养温度对产毒能力的影响

将菌饼接入pd培养液中,在光照、转速为120r/min的振荡条件下,分别在10、15、20、25、30℃条件下培养5天后,测定其产毒量。所有处理均按照1.3的方法提取含毒滤液,1.4的方法进行生物活性测定。测定菌斑直径,观察褪绿斑面积大小。

2.1.4不同ph值对产毒能力的影响

用稀释后的hcl和naoh溶液调节pd培养液的ph值,分别将ph值调至1、2、3、4、5、6、7、8、9。将菌饼接入pd培养液中,在25℃、光照、转速为120r/min的振荡条件下培养5天后,测定其产毒量。所有处理均按照1.3的方法提取含毒滤液,1.4的方法进行生物活性测定。测定菌斑直径,观察褪绿斑面积大小。

2.1.5通气量对产毒能力的影响

将菌饼接入pd培养液中,在25℃、光照条件下,分别静置培养(不振荡)、间歇振荡培养(每天振荡12h,转速为120r/min)、连续振荡培养(全天振荡,转速为120r/min),培养5天后,测定其产毒量。所有处理均按照1.3的方法提取含毒滤液,1.4的方法进行生物活性测定。测定菌斑直径,观察褪绿斑面积大小。

2.1.6不同光照对产毒能力的影响

将菌饼接入pd培养液中,在25℃、转速为120r/min的振荡条件下,分别置于全光照、昼夜自然交替、全黑暗条件下培养5天后,测定其产毒量。所有处理均按照1.3的方法提取含毒滤液,1.4的方法进行生物活性测定。测定菌斑直径,观察褪绿斑面积大小。

2.3数据处理

试验数据采用dps和excel软件进行分析。

3结果与分析

3.1不同培养液对产毒的影响

由表2可知,供试五种培养液均能使库尔勒香梨腐烂病菌产毒。菌株xl-1在pd培养液中产毒能力最强,坏死斑直径2.9mm。xl-2在czapek培养液中产毒能力最强,坏死斑直径2.8mm.菌株xl-3在ps培养液中产毒能力最强,坏死斑直径3.9mm。菌株xl-1和xl-2在五种培养液中无显著差异。菌株xl-3只有叶片煎汁马铃薯培养液与其他四种培养液差异显著,坏死斑直径1.4mm。菌株xl-1和xl-2在叶片煎汁马铃薯培养液中形成坏死斑直径也较小。说明叶片煎汁马铃薯培养液与其它培养液相比不利于香梨腐烂病菌产毒。pd培养液、ps培养液、czapek培养液和叶片煎汁蔗糖培养液均能作为香梨腐烂病菌产毒培养液。

表2不同培养液对库尔勒香梨腐烂病产毒的影响

注:图中数据为三次重复的平均值,小写字母表示差异达0.05显著水平

2.2不同培养时间对产毒的影响

由表3可知。菌株xl-1在1天的处理中产毒能力最弱,且差异显著。5天处理中产毒能力最强,坏死斑直径3.4mm,但3天、5天、7天处理无显著差异。xl-2在五个处理中均无显著差异,在7天的处理中产毒能力最弱,5天处理中产毒能力最强。菌株xl-3在1天的处理中产毒能力最弱,且差异显著。5天处理中产毒能力最强,坏死斑直径3.4mm。但3天、5天、7天、9天处理无显著差异。三个菌株在不同培养时间下产毒能力趋势保持一致,1天到3天的产毒能力上升,3天后,产毒能力趋于平缓。说明1天的处理条件香梨腐烂病菌产毒能力弱,可能由于1天的处理时间太短。1天到3天之间,产毒量增加迅速。3天后,病菌产毒含量达到高峰,基本保持在一个水平。

表3不同培养时间对库尔勒香梨腐烂病产毒的影响

注:图中数据为三次重复的平均值,小写字母表示差异达0.05显著水平

3.3不同培养温度对产毒的影响

由表4和图3可知,温度对产毒影响较大。三个菌株在五个温度处理条件下产毒含量差异性保持一致。在温度低于25℃时,库尔勒香梨腐烂病菌产毒能力随温度的升高而升高。25℃条件下坏死斑直径最大,且与其他它处理差异显著。25℃后,库尔勒香梨腐烂病菌产毒能力下降。20℃与30℃培养条件下坏死斑直径无显著差异。说明最适合产毒的培养基温度为20-30℃,其中25℃是最佳库尔勒香梨腐烂病菌产毒的条件,温度过高或过低都影响病菌产毒。

表4不同培养温度对库尔勒香梨腐烂病菌产毒的影响

注:图中数据为三次重复的平均值,小写字母表示差异达0.05显著水平

3.4不同ph值对产毒的影响

由表5和图4可以看出,在ph值1.0-6.0间,三个菌株产毒能力呈上升趋势。在ph值6.0-8.0间,库尔勒香梨腐烂病菌产毒能力最强。在ph值8.0-9.0间,产毒能力下降。菌株xl-1和xl-2在ph值5.0-8.0间产毒能力较好,无显著差异。坏死斑直径在ph值7.0时达到最大,分别为4.3mm和4.6mm。菌株xl-3在ph值2.0-9.0间,无显著差异。ph值8.0时,坏死斑直径最大,达5.9mm。三个菌株在不同ph处理条件下产毒能力的强弱基本一致。说明最适合产毒的培养基ph值为6-8,最佳产毒ph为7。

表5不同ph值对库尔勒香梨腐烂病菌产毒的影响

注:图中数据为三次重复的平均值,小写字母表示差异达0.05显著水平

3.5通气量对产毒的影响

由表6和图5可知,菌株xl-1和菌株xl-3在不同培养方式条件下差异性保持一致。全天振荡条件下香梨腐烂病菌产毒能力最强,菌株xl-1坏死斑直径达2.9mm,xl-2坏死斑直径达3.4mm。但全天振荡与间歇振荡培养条件无显著差异。静置培养条件下香梨腐烂病菌产毒能力最弱,菌株xl-1坏死斑直径达0.6mm,xl-2坏死斑直径达1.7mm。且差异显著。xl-2在全天振荡条件下产毒能力最强,在静置培养条件下产毒能力最弱。但在三个培养方式下的产毒含量无显著差异,可能由于数据过少造成。综上可得,与静置培养条件相比,振荡条件更适合库尔勒香梨腐烂病菌产毒。

表6通气量对库尔勒香梨腐烂病产毒的影响

注:图中数据为三次重复的平均值,小写字母表示差异达0.05显著水平

2.6光照条件对产毒的影响

由表7可知,光照条件对香梨腐烂病菌产毒具有影响。菌株xl-1和菌株xl-3差异性保持一致。在全黑暗条件下,坏死斑直径最大,分别达2.8mm和3.4mm。与昼夜交替条件下的产毒含量差异不显著。在全光照条件下,坏死斑直径最小,分别为2.0mm和2.3mm,且差异显著。菌株xl-2,在全黑暗条件下,坏死斑直径最大,达3.1mm,且差异显著。在全光照条件下,坏死斑直径最小,为1.9mm。说明黑暗条件有利于库尔勒香梨腐烂病菌产毒。光照条件不适合库尔勒香梨腐烂病菌产毒。

表7不同光照条件对库尔勒香梨腐烂病菌产毒的影响

注:图中数据为三次重复的平均值,小写字母表示差异达0.05显著水平

通过离体叶片针刺法能证明粗毒素对香梨叶片有毒害作用,离体叶片针刺法更加精确,本试验数据均采用离体叶片法测定的坏死斑直径。pd培养液、ps培养液、czapek培养液和叶片煎汁蔗糖培养液均能作为库尔勒香梨腐烂病菌最优产毒培养液。1天的处理条件不利于香梨腐烂病菌产毒;1天到3天之间,产毒量增加迅速;3天后,病菌产毒含量基本保持在一个水平。所得最适合产毒的培养基温度为20-30℃,其中25℃是最佳库尔勒香梨腐烂病菌产毒的条件;温度过高或过低都不利于病菌产毒。所得最适合产毒的培养基ph值为6-8,最佳产毒ph为7。黑暗较光照有利于产毒。振荡条件比静置培养有利于有利于库尔勒香梨腐烂病菌产毒。综上可知:最有利于库尔勒香梨腐烂病菌产毒的培养方式是:ph值为7的培养液在25℃黑暗条件下振荡培养3天以上。

以上所述,仅是本发明实施例的较佳实施例,并非对本发明实施例作任何形式上的限制,依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。

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