本发明涉及药材检测领域，且特别涉及一种龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱预处理方法及检测方法。
背景技术：
龙胆泻肝散是清代医学家汪昂所创制的名方，载于其所著的《医方集解》一书中，现收录于《中华人民共和国兽药典》2015年版二部。本药由龙胆、地黄、车前子、当归、黄芩等10味药材组成，是“龙胆泻肝汤”、“龙胆泻肝丸”和“柴胡味泻肝汤”三方加减化裁而得。龙胆泻肝散的处方包括：龙胆45g、车前子30g、柴胡30g、当归30g、栀子30g、生地黄45g、甘草15g、黄芩25g、泽泻45g和木通20g。龙胆泻肝散具有泻肝胆实火、清三焦湿热的功效，在兽药临床上主要用于目赤肿痛，淋浊，带下。
2015年版《中华人民共和国兽药典》二部中龙胆泻肝散的质量标准仅有显微鉴别和当归与黄芩的薄层鉴别，很难控制其质量以保证产品的安全性、有效性与质量可控性。但现有技术中龙胆泻肝散用地黄的薄层色谱测定的效果不理想，不能满足需求。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱预处理方法，该预处理方法能够使龙胆泻肝散中的地黄得以较好的分离，使薄层色谱检测结果更加明显和准确。
本发明的另一目的在于提供一种龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱检测方法，该测定方法对地黄具有优异的展开性能，硅胶薄层板上斑点的分离度较佳，检测过程中干扰因素少，检测结果准确。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱预处理方法，其包括以下步骤：以含有地黄的龙胆泻肝散作为第一样品，将第一样品按料液比1g：10-20ml溶解于醇溶液中，过滤，滤液蒸干后加水溶解，然后用乙酸乙酯提取，收集提取液。
本发明还提出一种龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱检测方法，其包括以下步骤：
以含有地黄的龙胆泻肝散和地黄标准品分别作为第一样品和第二样品，取等量第一样品和第二样品分别作为试验组和对照组，并进行以下处理：
按上述龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱预处理方法对第一样品进行预处理，并以第二样品代替第一样品进行相同的预处理，取等量第一样品的提取液和第二样品的提取液点样于同一硅胶薄层板，然后用展开剂展开，干燥，喷施显色剂并加热至硅胶薄层板上显现斑点。
展开剂为三氯甲烷、甲醇和氨水以体积比为13-15：0.8-1.2：0.05-0.15混合后的混合溶剂。
对比试验组和对照组的显色斑点在硅胶薄层板上的位置。
本发明实施例的龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱预处理方法及检测方法的有益效果是：预处理过程中将滤液蒸干后加入溶解，并用乙酸乙酯提取，能够大大提高后续检测过程中色斑的分离程度，便于观察和记录结果。该预处理方法能有效避免龙胆泻肝散中其它物质对地黄检测的影响，且经过该方式处理后能使检测效果更加明显，便于观察。
以体积比为13-15：0.8-1.2：0.05-0.15的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂作为展开剂，能针对性地对地黄所含成分进行充分展开，且能避免龙胆泻肝散中的其它组成成分对地黄成分的展开产生影响。此检测方法展开效果较佳，色斑分离度良好，检测过程中干扰因素少，检测结果准确。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱预处理方法及检测方法进行具体说明。
本发明实施例提供的龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱检测方法，主要包含样品预处理、展开和显色等步骤。
薄层色谱检测方法是色谱法中的一种，其原理为：利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。
该检测方法是一种微量、快速和简便的色谱方法。由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值(rf)。
化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此rf值较小。在给定的条件下(吸附剂、展开剂、板层厚度等)，化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据rf值鉴别化合物。
此外，薄层色谱可适用小量样品(几到几十微克甚至0.01μg)的分离，也可用于多达500mg样品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。特别适用于那些挥发性小的化合物，以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。
具体地，本实施例中龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱预处理方法包括以下步骤：将含有地黄的龙胆泻肝散作为第一样品(试验组)，然后将第一样品溶解于醇溶液中，过滤，取滤液，以除去第一样品中的非醇溶性物质。
作为可选地，上述第一样品例如可按料液比1g：10-20ml溶解于醇溶液中，优选的料液比为1g：12.5ml。此优选料液比可使第一样品中的醇溶性物质得以充分溶解，以利于检测结果准确。因甲醇溶液价格低廉且较易够买，故上述醇溶液优选为甲醇溶液。
进一步地，为了在减少醇用量的同时，能够提高龙胆泻肝散的溶解度，本实施例中在将第一样品溶解于醇溶液中后，还将其置于超声条件下处理，超声时间例如可以为25-35min，优选为30min。超声处理的功率例如可以为90-110w，频率例如可以为35-45khz。进一步地，超声的功率和频率分别优选为100w和40khz，在此条件下进行超声处理，可进一步促进第一样品中的醇溶性物质充分溶解于醇溶液中。
将超声后的溶液进行过滤，然后将滤液蒸干得到干物质，加水溶解上述干物质，然后再加入乙酸乙酯进行提取，收集提取液。作为可选地，加入的水的体积与干物质重量的比例可以为1g：4.5-5.5ml，水与乙酸乙酯的体积比可以为1：1-2。为了提高乙酸乙酯溶液中地黄有效成分的量，可对水溶解后的干物质进行不少于2次的提取，并合并多次提取后的乙酸乙酯提取液。在本方案中，将滤液蒸干后加水溶解并进行乙酸乙酯提取，能够大大提高后续检测过程中色斑的分离程度，便于观察和记录结果。
因后续点样所用的提取液较少，本实施例中还可将提取液蒸干，然后再用少量甲醇溶剂，例如2ml进行溶解，得到浓度较高、体积较少的样品溶液。经过蒸干浓缩再溶解后的样品溶液更利于点样和展开，以避免点样时样品浓度较低或较浓影响展开效果，造成拖尾或斑点分离度差的现象。
将上述提取液点样于硅胶薄层板。硅胶为极性吸附剂，具有较大的吸附量，本实施例选择硅胶薄层板，能针对性地分离酸性和中性物质。上述硅胶薄层板可以自行购买，也可自制。若硅胶薄层板购自市面，使用前则可以将其于110℃的条件下活化25-35min。若为自制，则尽量使硅胶薄层板表面均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破损及污染。
较佳地，本实施例中的硅胶薄层板为硅胶g薄层板。其原因在于一般的硅胶薄层板因硅胶薄层的机械性较差，故使用时在硅胶中加入5-20％的石膏，也即上述硅胶g薄层板。石膏起粘合作用，具有较好的耐腐性特点，将其加入硅胶薄层中，能提升硅胶薄层的机械性能。
点样可用毛细管或点样器械将滤液点样于上述硅胶薄层板上。点样的好坏直接影响分离效果，本实施例中优选点样成圆点状或条带状，当点样为圆点状时，圆点状的直径优选为不大于4mm，最佳为不大于2mm，以提高后期的展开效果，避免拖尾现象。
然后，用展开剂展开。展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素综合考虑。目前地黄的薄层鉴别所采用的展开剂组合种类多样，但由于不同药物中各组成成分不同，各成分在展开过程中会相互影响，因此，适用于其他药物的地黄薄层鉴别用的展开剂的组合方式和组成比例并不能够完全适合于龙胆泻肝散中地黄的鉴别。
由于地黄含有较多的氨基酸、地黄素、醇类物质和有机酸。鉴于此，综合考虑地黄成分与龙胆泻肝散中所含的其它物质的性质，本实施例中的展开剂优选为三氯甲烷、甲醇和氨水混合后的混合溶剂。
作为可选地，上述三氯甲烷、甲醇和氨水例如可以以体积比13-15：0.8-1.2：0.05-0.15混合。优选地，三氯甲烷、甲醇和氨水以体积比14：1：0.1混合。
按上述优选体积比混合所得的展开剂能针对性的对地黄所含成分进行展开，且龙胆泻肝散中的其它组成成分对地黄成分的展开基本无影响，展开效果较佳。
将展开剂盛放于展开容器(如展开缸或展开槽)中，将点样后的薄层板再放入盛有展开剂的展开容器内，较佳地，薄层板浸入展开剂的深度为距原点5mm。
作为可选地，本实施例中的展开时间例如可以控制在18-22min，优选地，展开时间为20min。展开时间控制在此范围，可避免时间过短造成斑点分离不明显。
展开后，干燥薄层板。因需鉴别的地黄成分为无色物质，需要借助显色剂并在加热条件下才能显色。因此对干燥后的薄层板喷施显色剂并加热至硅胶薄层板上显现斑点。就本方案中的地黄成分，显色剂选用香草醛硫酸溶液，较佳地，该香草醛硫酸溶液中香草醛的体积浓度可以为4.5-5.5％。作为可选地，加热可以在不超过105℃的温度下进行，以避免加热温度过高，使鉴定成分发生化学变化，生成其它物质。
根据样品中化合物组分的极性，不同化合物在薄层板上移动的距离不同，极性强的化合物会“粘”在极性的硅胶上，在薄层板上移动的距离比较短；而非极性的物质将会在流动的溶剂相中保留较长的时间，从而在板上移动较大的距离。化合物在薄层板上的移动距离大小用rf值来表达，由此，可以根据rf值来确定化合物的类型等。
此外，本实施例中以地黄标准品作为第二样品。
取与第一样品等量的第二样品(对照组)，按照上述第一样品的处理步骤和方法，对第二样品进行相同的处理。值得说明的是，本实施例中第一样品和第二样品在获得提取液后，是取等量第一样品的提取液和第二样品的提取液点样于同一硅胶薄层板，然后展开、干燥和显色。
对比经相同处理后的试验组和对照组在硅胶薄层板上相对应的位置是否有相同颜色的斑点。有则说明试验组和对照组所含化合物成分一致，无则说明试验组和对照组所含化合物成分不一致。
为了提高本检测方法的准确性，实施例中还设置了阴性比对组，该阴性比对组为不含地黄的龙胆泻肝散。取与第一样品及第二样品等量的阴性比对组，并按照上述第一样品、第二样品的处理步骤和方法进行相同处理。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
以含有地黄的龙胆泻肝散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取1g第一样品溶于10ml的甲醇溶液中，过滤，蒸干滤液得到干物质，加水溶解干物质，然后用乙酸乙酯提取，收集提取液。干物质、水和乙酸乙酯的量为1g：4.5ml：4.5ml。将提取液点样于硅胶g薄层板，点样成直径为4mm的圆点状，然后用体积比为13：0.8：0.05的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶g薄层板展开18min。展开后，干燥薄层板，并喷施香草醛的体积浓度为4.5％的香草醛硫酸溶液，然后于105℃的温度下加热至硅胶g薄层板上显现斑点。
以地黄标准品作为对照组，并按照上述步骤和方法进行相同处理。对比经相同处理后的试验组和对照组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例2
以含有地黄的龙胆泻肝散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于40ml的甲醇溶液中，于功率为90w、频率为35khz的超声条件下超声25min，然后过滤。蒸干滤液得到干物质，加水溶解干物质，然后用乙酸乙酯提取，收集提取液。干物质、水和乙酸乙酯的量为1g：5.5ml：11ml。将提取液点样于硅胶g薄层板，点样成直径为1.5mm的圆点状，然后用体积比为15：1.2：0.15的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶g薄层板展开22min。展开后，干燥薄层板，并喷施香草醛的体积浓度为5.5％的香草醛硫酸溶液，然后于100℃的温度下加热至硅胶g薄层板上显现斑点。
分别以地黄标准品和不含地黄的龙胆泻肝散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例3
以含有地黄的龙胆泻肝散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于30ml的甲醇溶液中，于功率为110w、频率为45khz的超声条件下超声35min，然后过滤。蒸干滤液得到干物质，加水溶解干物质，然后用乙酸乙酯提取经水溶解后的干物质2次，合并2次提取所得的提取液。干物质、水和乙酸乙酯的量为1g：5ml：7.5ml。将提取液点样于硅胶g薄层板，点样成直径为3mm的圆点状，然后用体积比14：1：0.1的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶g薄层板展开20min。展开后，干燥薄层板，并喷施香草醛的体积浓度为5％的香草醛硫酸溶液，然后于102.5℃的温度下加热至硅胶g薄层板上显现斑点。
分别以地黄标准品和不含地黄的龙胆泻肝散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例4
以含有地黄的龙胆泻肝散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于25ml的甲醇溶液中，于功率为100w、频率为40khz的超声条件下超声30min，然后过滤。蒸干滤液得到干物质，加水溶解干物质，然后用乙酸乙酯提取经水溶解后的干物质3次，合并3次提取所得的提取液。干物质、水和乙酸乙酯的量为1g：5ml：7.5ml。将提取液蒸干，再用2ml甲醇溶解，得到样品溶液。将样品溶液点样于硅胶g薄层板，点样成条带状，然后用体积比14：1：0.1的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶g薄层板展开20min。展开后，干燥薄层板，并喷施香草醛的体积浓度为5％的香草醛硫酸溶液，然后于98℃的温度下加热至硅胶g薄层板上显现斑点。
分别以地黄标准品和不含地黄的龙胆泻肝散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例5
以含有地黄的龙胆泻肝散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于25ml的甲醇溶液中，于功率为100w、频率为40khz的超声条件下超声30min，然后过滤。蒸干滤液得到干物质，加水溶解干物质，然后用乙酸乙酯提取经水溶解后的干物质2次，合并2次提取所得的提取液。干物质、水和乙酸乙酯的量为1g：5ml：7.5ml。将提取液蒸干，再用2ml甲醇溶解，得到样品溶液。将样品溶液点样于硅胶g薄层板，点样成直径为2mm的圆点状，然后用体积比14：1：0.1的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶g薄层板展开20min。展开后，干燥薄层板，并喷施香草醛的体积浓度为5％的香草醛硫酸溶液，然后于101℃的温度下加热至硅胶g薄层板上显现斑点。
分别以地黄标准品和不含地黄的龙胆泻肝散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
试验例1
按实施例1-5的方法对龙胆泻肝散中的地黄成分进行薄层色谱检测。实施例1-5的结果均显示：试验组和对照组在薄层色谱对应的位置均出现了相同颜色的斑点，且色斑分离度极佳。此外，实施例2-5的结果还显示阴性对比组的薄层色谱在试验组显色斑点对应的位置未出现相同颜色的斑点，说明该阴性对比组对试验组未产生干扰，也即说明龙胆泻肝散中的其它组成成分对地黄成分的检测效果无影响，验证了本检测方法的可行性。
试验例2
本试验例就实施例5中样品的预处理方法进行改变，直接将超声后处理后的滤液蒸干，加甲醇溶解，得到样品溶液(也即无对蒸干后的滤液加水溶解以及用乙酸乙酯提取的步骤)，其余处理均相同。按本试验例处理后所得结果显示：试验组和对照组的薄层色谱显示斑点清晰，试验组和对照组的色谱对应的位置，斑点重合，不便于区分；且阴性对比组的色谱在对应位置也存在干扰。
说明预处理过程中蒸干后的滤液未进行加水溶解以及用乙酸乙酯提取的步骤，会造成阴性对比组对试验组产生干扰，也即说明龙胆泻肝散中的其它组成成分对地黄成分的检测效果有影响。
因此，进一步验证了实施例5中龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱检测方法的可行性。
综上所述，本发明实施例的龙胆泻肝散中地黄的薄层色谱预处理方法能有效避免龙胆泻肝散中其它物质对地黄检测的影响，且经过该方式处理后能使检测效果更加明显，便于观察。此外，本发明实施例中的检测方法对地黄具有优异的展开性能，硅胶薄层板上斑点的分离度较佳，检测过程中干扰因素少，检测结果准确。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。