一种测定生鲜乳样品中的多种霉菌毒素含量的方法与流程

本发明涉及食品检验检疫领域，更特别地，涉及一种测定生鲜乳样品中的多种霉菌毒素含量的方法。

背景技术：

牛奶已成为人们生活的必需品，尤其婴幼儿牛奶是母乳的最佳替代品，但霉菌毒素已成为牛奶的主要质量安全风险因子之一，严重威胁人类健康。霉菌毒素在牛奶加工过程中，无论是巴氏杀菌还是高温杀菌均无法降解霉菌毒素，霉菌毒素可以完整残留至奶产品中，因此，牛奶中霉菌毒素越来越受到人们的广泛关注。

目前，监测牛奶中霉菌毒素污染状况的方法主要为酶联免疫吸附法，该方法广泛应用于霉菌毒素分析检测，但由于假阳性和不能精确定量等缺点限制了其进一步应用。因此，基于薄层色谱法、气相色谱、高压液相色谱等技术的定量检测方法已经建立，但这些方法只能检测一种或一类霉菌毒素，已不能满足现代奶业中霉菌毒素的监测和科研需求。

因此，需要一种新的测定生鲜乳中的多种霉菌毒素的方法。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供了一种测定生鲜乳样品中的多种霉菌毒素含量的方法，其包括以下步骤：

s1：从所述生鲜乳样品中提取霉菌毒素提取物；

s2：对所述霉菌毒素提取物进行液相色谱分离，得到洗脱级分；

s3：使用三重四极杆质谱仪对所述洗脱级分进行质谱鉴定，确定霉菌毒素的种类和含量。

本发明采用三重四极杆质谱仪，其比单四级杆质谱仪精度更高，可更好地分离目标化合物和干扰杂质；从而提供可靠、准确的数据。本方法通过三重四极杆质谱仪的多反应监测扫描方式采集各霉菌毒素的特征母离子及其子离子信息,结合保留时间和离子丰度比进行定性和定量分析。

优选地，所述多种霉菌毒素为以下霉菌毒素中的多种：黄曲霉毒素m2、黄曲霉毒素m1、黄曲霉毒素g2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素b1、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素b和赭曲霉毒素a。

优选地，s1中使用体积分数为5-10％的乙腈水溶液从所述生鲜乳样品中提取所述霉菌毒素提取物。体积分数为5-10％的乙腈水溶液可有效提取所有14种霉菌毒素，提取率超过纯水和体积分数20％的乙腈水溶液。

进一步地，s1包括以下步骤：

s11：取生鲜乳样品，4500rpm离心后进行中速滤纸过滤；

s12：将s11中过滤得到的滤液与所述乙腈水溶液混匀；

s13：使s13得到的混合溶液通过三合一多毒素抗体亲和柱(黄曲霉毒素,赭曲霉毒素，玉米赤霉烯酮类毒素抗体)，并用甲醇洗脱，吹干，得到霉菌毒素残渣；

s14：用体积分数10％的甲醇水溶液溶解所述霉菌毒素残渣，用0.22μm的滤膜过滤，得到所述霉菌毒素提取物。

优选地，s2中液相色谱使用kinetexc18色谱柱。

优选地，所述三重四极杆质谱仪采取mrm模式定量。

优选地，还设置有不含霉菌毒素的生鲜乳作为阴性对照。

附图说明

图1为14种霉菌毒素的总离子流色谱图；

图2为使用不同的提取溶剂提取霉菌毒素得到的14种霉菌毒素的回收率统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.生鲜乳中霉菌毒素的提取

取100g添加有14种霉菌毒素的生鲜乳，4500rpm离心10min后，中速滤纸过滤。称取20.0g滤液，加入20ml10％乙腈水溶液(体积比)，摇匀后通过3合一多毒素免疫亲和柱。完成后，用20ml超纯水清洗亲和柱。挤干亲和柱中水分后，使用3ml甲醇洗脱，40℃用氮气吹干洗脱液。使用1.0ml10％甲醇水溶液(体积比)溶解残渣，过0.22μmptfe滤膜，待液相色谱测试。所述14种霉菌毒素分别为黄曲霉毒素m2、黄曲霉毒素m1、黄曲霉毒素g2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素b1、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素b和赭曲霉毒素a。

以不含霉菌毒素的生鲜乳为对照。

2.液相色谱

将上述处理得到的样品进行液相色谱测定，条件如下：

1)色谱柱：kinetexc18,100*2.1mm(i.d.),1.7μm，或相当者；

2)流动相：流动相a：水溶液(含0.01％甲酸(v/v)、0.1mm甲酸铵)；流动相b：甲醇。梯度洗脱程序见表1；流速：300μl/min；

柱温：40℃；

进样量：10μl。

表1液相色谱的梯度洗脱程序

3.质谱

离子源：电喷雾电离正负离子模式(esi±)；

扫描模式：多反应监测(mrm)；

雾化气流速：3l/min；

dl温度：300℃；

加热模块温：500℃；

干燥气流速：20l/min；

mrm参数：见表2

表214种霉菌毒素的mrm参数

*为定量离子

4.测定

根据样液中被测化合物的含量情况，选定浓度接近的标准工作溶液进行分析。按浓度由小到大的顺序依次分析混合基质标准工作溶液，得到混合基质标准工作溶液浓度与峰面积的工作曲线。混合基质标准工作溶液和样液中待测化合物的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对混合基质标准工作溶液和样液等体积进样测定。

5.结果计算与表述

采用外标法定量，按以下公式计算残留量。计算结果需扣除空白值。

式中：

x—试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；

c—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；

v—样品溶液最终定容体积，单位为毫升(ml)；

m—最终样品溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。

6.测定低限

生鲜乳中赭曲霉毒素b，黄曲霉毒素b2，黄曲霉毒素b1的测定低限为0.005μg/kg；赭曲霉毒素a，黄曲霉毒素g2，黄曲霉毒素g1，黄曲霉毒素m2，黄曲霉毒素m1的测定低限为0.01μg/kg；玉米赤霉酮，玉米赤霉烯酮，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇的测定低限为0.05μg/kg。

7.回收率

回收率可指示方法的提取效率。14种霉菌毒素在生鲜乳中的添加浓度及回收率如表3所示，从表中可知，本发明的方法能够检测到这14种霉菌毒素，并进行定量。

表314种霉菌毒素在生鲜乳中的添加浓度及回收率

8.不同提取溶剂对回收率的影响

对生鲜乳分别使用以下溶剂提取霉菌毒素：不提取、纯水、体积分数5％的乙腈水溶液、10％乙腈水溶液和20％乙腈水溶液。得到的提取物进行液相色谱和质谱检测，图1为14种霉菌毒素的总离子流色谱图，得到的回收率如图2所示，从图中可知，使用5％和10％的乙腈水溶液对这14种霉菌毒素的提取效率都比较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。