一种功能化的SERS造影剂及其制备方法和用途与流程
一、技术领域
本发明涉及一种功能化的sers造影剂及其制备方法和用途，属于表面增强拉曼散射造影剂领域。
二、
背景技术：
表面增强拉曼散射(sers)技术可以提供目标物的指纹光谱信息，灵敏度高、光谱峰窄且不受水的干扰，已被广泛应用于生命科学领域。与传统的放射性造影剂以及荧光造影剂相比，sers造影剂可以有效地避免放射性材料的潜在危害以及样品自身荧光的干扰和光漂白效应等。典型的sers造影剂是以贵金属纳米粒子为增强基底、拉曼活性物质为示踪剂、靶向配体为识别单元的纳米生物探针。目前，主要的制备方式有三种：(1)将拉曼活性物质和靶向配体直接修饰到贵金属纳米粒子表面；(2)用氧化硅或聚合物包被拉曼活性分子标记的纳米粒子并将靶向配体固定于壳层结构上；(3)将拉曼活性分子与靶向配体共价结合，进而以单层组装的方式修饰到纳米粒子表面。由于拉曼标记分子和配体的数量都达到了最大化，第三种制备方式能明显地提高sers造影剂对目标物的结合能力并放大检测信号。然而，这种sers造影剂并没有取代传统的造影剂而广泛应用于细胞、组织以及活体肿瘤的靶向成像及治疗中，其中的一个主要原因是缺乏一种通用的合成策略来制备这种高选择性和高灵敏性的sers造影剂。
点击化学是一种合成碳杂原子化合物的新方法，该方法的主要特点是原料易得、操作简单、反应条件温和、产率高、无副产物。通过点击化学合成策略可将具有拉曼活性的叠氮或炔基化合物与配体偶联的炔基或叠氮化合物进行共价连接，进而发展出一系列的功能化sers造影剂。目前，这种基于点击化学功能化的sers造影剂及其应用还未见报道。
三、
技术实现要素：
本发明旨在提供一种功能化的sers造影剂及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是设计遴选一种通用的合成策略来制备高选择性和高灵敏性的sers造影剂。本发明的制备方法反应条件温和，标记效率高，并在肿瘤细胞诊断的过程中作为造影剂使用。
本发明功能化的sers造影剂，其结构通式为下式ⅰ或式ⅱ：
其中
r表示具有拉曼活性的结构单元，为5-巯基-2-硝基苯甲酸衍生物，其结构通式为：
l表示靶向配体，为通过酰胺化反应得到的叶酸衍生物，具体结构式为：
本发明功能化的sers造影剂的制备方法，是将含有叠氮官能团的拉曼活性物质共价结合在贵金属纳米粒子表面，并与含有炔基官能团的靶向配体发生点击化学反应得到目标产物。
所述含有叠氮官能团的拉曼活性物质是通过5-巯基-2-硝基苯甲酸的羧基官能团与氨基聚乙二醇叠氮的氨基官能团耦合反应得到的，其结构通式为：
所述含有炔基官能团的靶向配体是通过双环[6.1.0]壬炔胺的氨基官能团，或丙炔胺的氨基官能团与叶酸的羧基官能团耦合反应得到的，其具体结构式为：
所述点击化学反应为叠氮官能团和炔基官能团发生的1,3偶极环加成反应。
本发明功能化的sers造影剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将40μl浓度为0.03m的含有叠氮官能团的拉曼活性物质加入到1ml浓度为5.0×10-10-1.0×10-8m的贵金属纳米粒子溶液中，室温条件下搅拌3小时，离心、洗涤后得到拉曼活性物质标记的纳米粒子；
步骤2：将60μl0.02m含有炔基官能团的靶向配体加入到步骤1得到的拉曼活性物质标记的纳米粒子中，室温下通过1,3偶极环加成反应得到功能化的sers造影剂。
步骤2的1,3偶极环加成反应可以在催化剂存在的条件下进行，也可以在无催化剂的条件下进行，是否需要添加催化剂与含有炔基官能团的靶向配体中所含炔基的类型有关：若为含八元环结构的炔基化合物，例如实施例1，就无需催化剂，反应时间为0.5-1小时；若为其它炔基化合物，例如实施例2，就需要添加催化剂，反应时间为6-24小时。
所述催化剂为一价铜离子，由50μl0.1m硫酸铜溶液和50μl0.2m抗坏血酸溶液反应得到。
本发明功能化的sers造影剂的用途，是在肿瘤细胞的靶向成像诊断中作为造影剂的应用。
所述肿瘤细胞为人口腔表皮癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞或肺癌细胞等膜表面表达叶酸受体的肿瘤细胞。
本发明功能化的sers造影剂的应用，是在肿瘤细胞的靶向成像诊断中作为造影剂的应用，过程如下：将10-200μl5.0×10-10-1.0×10-8m功能化的sers造影剂加入到2ml含有肿瘤细胞的培养基中，在37℃、5％co2条件下共培养0.5-12h，洗涤后加入ph值7.0的pbs溶液并进行sers成像。
本发明通过点击化学的策略来合成功能化的sers造影剂，并利用靶向配体与肿瘤细胞的特异性相互作用实现对肿瘤细胞的诊断。
与现有的技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明功能化的sers造影剂是在基底上通过一种反应条件温和、产率高、通用型的点击化学功能化修饰的方法得到的。
2、本发明功能化的sers造影剂中的拉曼活性分子和靶向配体能以单层组装的方式共价固定于基底表面，可最大限度地提高sers造影剂对目标物的结合能力并放大检测信号。
3、本发明使得sers造影剂应用范围拓宽，可选择大量不同的具有拉曼活性的叠氮或炔基化合物作为示踪剂、以及不同的炔基或叠氮化合物偶联的配体作为识别单元，为真正使sers这种高灵敏度的成像技术普遍应用于生物学成像奠定基础。
四、附图说明
图1为本发明功能化sers造影剂制备的流程示意图。
图2为本发明实施例1制备的sers造影剂的透射电子显微镜图(右上角为对应的光学照片)。从图2中可以看到这种功能化的sers造影剂具有很好的单分散性。
图3为本发明实施例1中sers造影剂对人口腔表皮癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞的sers成像。其中，激发光源波长是633nm。最左图代表暗场光散射成像，中间图代表sers成像，最右图代表相应位置的sers光谱。这一结果表明点击功能化的sers造影剂可以应用于肿瘤细胞的诊断。
五、具体实施方式
为了进一步理解本发明，非限定实施例如下。
实施例1：
本实施例中功能化的sers造影剂的制备方法括如下：
1、含有叠氮官能团的拉曼活性物质的合成—5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)类叠氮化合物
将0.059g羧基活化的5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(dnba)溶解于2ml二甲亚砜中，并将80μl5.0m的氨基聚乙二醇叠氮(nh2-peg-n3)逐滴加入，室温条件下搅拌过夜，然后向反应液中加入大量的水，即得到桔黄色的沉淀物；经过离心、洗涤、真空烘干，即得到dnba类叠氮化合物(dnba-n3)。
2、贵金属纳米粒子的制备—金纳米空心球
取100ml超纯水于250ml三口烧瓶中，依次加入100μl0.4m氯化钴溶液和200-900μl0.1m柠檬酸钠溶液，通入氮气1小时后，迅速注入100-400μl1m硼氢化钠溶液，待硼氢化钠反应完全后，分10次加入500μl0.1m氯金酸溶液，然后停止通入氮气，溶液逐渐变为深蓝色，即得粒径为30-100nm的金纳米空心球。
3、dnba-n3修饰的金纳米空心球
将步骤2制备的金纳米空心球离心(4000转/分钟，40分钟)并分散于4ml超纯水中，获得溶胶；取1ml溶胶，加入40μl0.03m的dnba-n3(二甲亚砜溶液)，室温下搅拌3小时，然后离心、洗涤，即得到dnba-n3修饰的金纳米空心球。
4、含有炔基官能团的靶向配体的合成—双环[6.1.0]壬炔胺偶联的叶酸分子
将0.05g叶酸分子溶解于2ml二甲亚砜中，依次加入0.025g二环己基碳二亚胺和0.013gn-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌30分钟，然后将0.036g双环[6.1.0]壬炔胺逐滴加入并搅拌过夜，过滤除去白色沉淀，再向反应液中加入30ml水，即得到桔黄色的沉淀物；经过离心、洗涤、冷冻干燥，即得到双环[6.1.0]壬炔胺偶联的叶酸分子(bcn-folate)。
5、点击化学反应制备功能化的sers造影剂
取1ml5.0×10-10m步骤3制备的dnba-n3修饰的金纳米空心球，加入60μl0.02mbcn-folate，室温条件下反应1小时，离心、洗涤，即得到功能化的sers造影剂，结构如下：
6、功能化sers造影剂用于肿瘤细胞的成像
取200μl5.0×10-10m步骤5制备的sers造影剂，分别加入到2ml含有人口腔表皮癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞的培养基中，在37℃、5％co2条件下共培养0.5-12h，洗涤后分散于ph值7.0的pbs溶液中并进行sers成像。成像结果见图3。
实施例2：
本实施例中功能化的sers造影剂的制备方法括如下：
1-3的制备步骤同实施例1。
4、含有炔基官能团的靶向配体的合成—丙炔胺偶联的叶酸分子
将0.5g叶酸分子溶解于10ml二甲亚砜中，依次加入0.247g二环己基碳二亚胺和0.13gn-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌30分钟，然后加入0.062g丙炔胺并搅拌24小时，过滤除去白色沉淀，再向反应液中加入250ml水，即得到桔黄色的沉淀物；经过离心、洗涤、真空干燥，即得到丙炔胺偶联的叶酸分子。
5、点击化学反应制备功能化的sers造影剂
取1ml5.0×10-10m步骤3制备的dnba-n3修饰的金纳米空心球，加入60μl0.02m丙炔胺偶联的叶酸分子，再依次加入50μl0.1m硫酸铜溶液和50μl0.2m抗坏血酸溶液(通过硫酸铜与抗坏血酸反应得到催化剂一价铜离子)，室温条件下反应24小时，离心、洗涤，即得到功能化的sers造影剂，结构如下：
6、功能化sers造影剂用于肿瘤细胞的成像
取200μl5.0×10-10m步骤5制备的sers造影剂，分别加入到2ml含有人口腔表皮癌细胞、宫颈癌细胞和肺癌细胞的培养基中，在37℃、5％co2条件下共培养0.5-12h，洗涤后分散于ph值7.0的pbs溶液中并进行sers成像。
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