一种在线快速筛选和定量中药中抗氧化活性成分的方法与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种既能筛选又能定量中药中的抗氧化活性成分的方法。

背景技术：

近年来，科学家们越来越相信活性氧能够破坏细胞的主要结构尤其是脂类和dna，然后引起细胞坏死，促进衰老甚至致癌。而抗氧化活性可清除氧自由基，从而抑制老年病，各种心脑血管疾病和神经退行性疾病，并且能预防癌症的发生，延缓衰老。天然产物，尤其是中药中已经被证明含有大量的抗氧化活性成分。因此，我们应该把中药作为寻找抗氧化物的重点资源。

银杏叶是一种具有抗氧化活性的中药，被广泛用于治疗各种老年病。以银杏叶提取物为主要原料制成的舒血宁注射液也同样具有抗氧化活性，因其几乎无副作用而常被用于治疗冠心病，心绞痛和脑血管痉挛等心血管疾病。考虑到用药的安全性，应该全面控制舒血宁注射液的质量。尽管已经有很多方法用于研究中药中的抗氧化活性成分，如lc(s.lin,studiesonqualitycontrolofshuxueninginjections.tcmuniv.offujianmaster's(2014))，lc-ms(j.liang,adynamicmultiplereactionmonitoringmethodforthemultiplecomponentsquantificationofcomplextraditionalchinesemedicinepreparations:niuhuangshangqingpillasanexample,j.chromatogr.a,1294(2013)58-69)和gc-ms(y.hu,w.kong,x.yang,l.xie,j.wen,m.yang,gc-mscombinedwithchemometrictechniquesforthequalitycontrolandoriginaldiscriminationofcurcumaelongaerhizome:analysisofessentialoils,j.sep.sci.37(2014)404-411)，但是分析舒血宁注射液的方法却很少。有人用lc-ms来研究舒血宁，但也只是测了其中各种活性成分的含量(j.zaiyou,w.wenquan,x.guifang,m.li,h.junling,comprehensivequalityevaluationofchishaobyhplc,nutrhosp.28(2013)1681-1687)。另一个存在的问题就是，现在已有的方法不能同时从药理活性和含量两方面综合地对舒血宁进行质量评价。xiao-pingding,jinqi和yan-xuchang等人建立了一种在线hplc-dad-cl的方法结合抗氧化活性对银杏叶进行质量控制(x.p.ding,q.jin,y.x.chang,l.l.mu,d.n.zhu,b.y.yu,p.s.xie,t.a.vanbeek,qualitycontrolofflavonoidsinginkgobilobaleavesbyhigh-performanceliquidchromatographywithdiodearraydetectionandon-lineradicalscavengingactivitydetection,j.chromatogr.a,1216(2009)2204-2210)。如果借鉴此方法来分析舒血宁注射液，会存在耗时长和有机溶剂消耗大等问题。

作为现代新兴的一种分析手段，毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)因为具有易操作，分析时间段，高效和低耗的优点被广泛应用在包括药物分析(d.s.el,h.d.a.elhady,d.g.c.g.k.scriba,recentadvancesincapillaryelectrophoreticmigrationtechniquesforpharmaceuticalanalysis(2013-2015)，electrophoresis,37(2016)1591-1608)，生物活性筛选和天然产物的质量控制的许多方面。例如，dubber和kanfer应用反转流向-胶束电动色谱来确定银杏叶中的黄酮类和萜内酯类化合物(m.j.dubber,applicationofreverse-flowmicellarelectrokineticchromatographyforthesimultaneousdeterminationofflavonolsandterpenetrilactonesinginkgobilobadosageforms,j.chromatogr.a,1122(2006)266-274)，此方法会减少有机试剂的使用但是并不能反映出银杏叶的抗氧化活性。除此之外，yan-xuchang等建立了一种在线dpph-ce-dad(dad：二极管阵列检测器)方法来全面的评价热毒宁注射液，这种方法把dpph和ce整合在一起测得了热毒宁注射液的总抗氧化活性和每种有抗氧化活性的成分的含量(y.x.chang,j.liu,y.bai,j.li,e.w.liu,j.he,x.c.jiao,z.z.wang,x.m.gao,b.l.zhang,theactivity-integratedmethodforqualityassessmentofreduninginjectionbyon-linedpph-ce-dad,plosone,9(2014)e106254)。该方法可以解决传统方法不能反映样品活性的问题，但是该方法中分离活性成分和测总的抗氧化活性的条件不同。考虑到上述各种问题，有必要建立一种简单、快速、可靠的方法来全面的评价中药注射液的药理作用和质量。

自由基加入实验是最初用于测定中药及其制剂抗氧化活性的方法，此方法大多数通过酶标仪来实现，氧自由基主要使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts⁺)。应用abts⁺来测定中药或其制剂的抗氧化活性的方法一般都是结合紫外分光光度计的离线模式(s.h.hwang,z.wang,h.n.yoon,s.s.lim,xanthiumstrumariumasaninhibitorofα-glucosidase,proteintyrosinephosphatase1β,proteinglycationandabts⁺fordiabeticanditscomplication,molecules,21(2016)；x.wang,x.li,h.li,reassessmentofantioxidantactivityofbaicaleininvitro,asianj.pharm.biomed.research,1(2011)186-194)，很明显，这种方法的操作需要一步步的进行离线反应、分离检测，比较复杂。为了简化操作，在线lc-abts⁺方法测定中药抗氧化活性依次被报道(k.m.kalili,s.s.de,h.t.van,f.lynen,v.a.de,comprehensivetwo-dimensionalliquidchromatographycoupledtotheabtsradicalscavengingassay:apowerfulmethodfortheanalysisofphenolicantioxidants,anal.andbioanal.chem.406(2014)4233-4242；k.j.lee,n.y.song,y.c.oh,w.k.cho,j.y.ma,isolationandbioactivityanalysisofethylacetateextractfromacertegmentosumusinginvitroassayandon-linescreeninghplc-abts(+)system,j.anal.methodsinchem.2014(2014)150509；a.a.antioxidantcomponentsofviburnumopulusl.determinedbyon-linehplc-uv-abtsradicalscavengingandlc-uv-esi-msmethods,foodchem.175(2015)106-114)。但是，由于分析仪器仍是液相，整个实验过程中有机试剂的使用量依然很大。为了解决存在的问题，我们通过在线整合ce和abts⁺建立一种从中药中快速筛选抗氧化活性成分的方法，并且选用舒血宁为例来具体阐述该方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种在线快速筛选或/和定量中药中的抗氧化活性成分的abts⁺-ce-dad方法，该法可适用于分离、筛选中药及其注射液中的抗氧化活性成分并对样品进行质量控制。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种在线快速筛选或/和定量中药中的抗氧化活性成分的abts⁺-ce-dad方法，所述abts为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，所述ce为毛细管电泳仪，所述dad为二极管阵列检测器，该法的毛细管电泳水相缓冲液的组成是为10mm～30mm磷酸盐，0mm～10mm的β-环糊精，20mm～60mm的十二烷基硫酸钠和体积百分比为2.5％～10％的乙腈，其中所述的磷酸盐是通过nah2po4和na2hpo4混合得到的；所述毛细管电泳水相缓冲液的ph值为6.5～7.5；整个实验过程中，电压是18kv～22kv，卡盒的温度控制在19℃～25℃；中药样品的检测波长是360nm，abts⁺的检测波长是405nm。

在一些实施方式中，所述毛细管电泳水相缓冲液的组成中的所述磷酸盐选自10mm～20mm或20mm～30mm，优选20mm。

在一些实施方式中，所述毛细管电泳水相缓冲液的组成中的所述磷酸盐是通过等摩尔量的nah2po4和na2hpo4混合得到的。

在一些实施方式中，所述毛细管电泳水相缓冲液的组成中的所述β-环糊精选自0mm～5mm或5mm～10mm，优选5mm。

在一些实施方式中，所述毛细管电泳水相缓冲液的组成中的所述十二烷基硫酸钠选自20mm～40mm或40mm～60mm，优选40mm。

在一些实施方式中，所述毛细管电泳水相缓冲液的组成中的所述乙腈体积百分比选自2.5％～5％、5％～7.5％、7.5％～10％，优选7.5。

在一些实施方式中，所述毛细管电泳水相缓冲液的ph值选自6.5～7.0或7.0～7.5，优选7.0。

在一些实施方式中，所述电压选自18kv～20kv或20kv～22kv，优选20kv；所述卡盒的温度控制选自19℃～22℃或22℃～25℃，优选22℃。

在一些实施方式中，本发明在线筛选或/和测定抗氧化活性成分的毛细管电泳水相缓冲液的组成是为20mm磷酸盐，50mm的β-环糊精，40mm的十二烷基硫酸钠和体积百分比为7.5％的乙腈，其中所述的磷酸盐是通过等摩尔量nah2po4和na2hpo4混合得到的；所述毛细管电泳水相缓冲液的ph值为7.0；整个实验过程中，电压是20kv，卡盒的温度控制在22℃；中药样品的检测波长是360nm，abts⁺的检测波长是405nm；中药样品及abts⁺的进样都是在50mbar压力下进样5s。

在一些实施方式中，所述中药是舒血宁注射液。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明建立的在线abts⁺-ce-dad方法可以用来从中药注射液中筛选和定量抗氧化活性成分，并且对相应的中药注射液进行质量控制。相关文献库中并没有发现这种在线abts⁺-ce-dad方法分析中药注射液，而且也是首次将abts⁺与ce在线结合。

(2)用本发明方法，在同一条件下可以快速测得舒血宁注射液的总抗氧化活性并且成功地确定具有抗氧化活性的成分，随后这些活性成分的含量也可以被测定。

(3)ce在此方法中不仅是一个分离工具而且是一个可以发生反应的容器。在本发明研究过程中，对该在线abts⁺-ce-dad方法的方法学验证，结果证明本次工作建立的活性整合方法可适用于分离、筛选中药及其注射液中的抗氧化活性成分并对样品进行质量控制。

附图

图1：各参数对十四个化合物峰(包括abts+)的迁移时间和分离度的作用

其中：图1(a)为毛细管电泳水相缓冲液ph值的作用；

图1(b)为缓冲盐浓度的作用；

图1(c)为十二烷基硫酸钠(sds)浓度的作用；

图1(d)为β-环糊精(β-cd)浓度的作用；

图1(e)为乙腈(acn)浓度的作用；

图1(f)为电压的作用；

图1(g)为温度的作用；

其中图中横坐标，1为蝶豆素、2为芦丁、3为异槲皮苷、4为槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷、5为山奈酚-3-o-芸香糖苷、6为水仙苷、7为山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷、8为大波斯菊苷、9为3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、10为槲皮素、11为3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、12为山奈酚、13为异鼠李素。

图2：“abts⁺”与“abts⁺溶液在线混合舒血宁注射液”的电泳图谱

其中：高的是“abts⁺”的电泳图谱，低的是“abts+与舒血宁注射液在线混合后的”电泳图谱。

图3：舒血宁电泳图谱

其中：上面是舒血宁与水在线混合的电泳图谱，下面是舒血宁与abts⁺在线混合的电泳图谱。

图4：十三个化合物的混合标准品与舒血宁注射液的电泳图谱

其中：上面是标准品混合物的电泳图谱，下面是舒血宁注射液的电泳图谱。

图5：舒血宁注射液总的含量与总抗氧化活性的关系。

具体实施方案

下述是结合具体实施例进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例：

1仪器和材料

1.1仪器

毛细管电泳仪：agilent7100，二极管阵列检测器dad；未涂层石英毛细管柱：河北永年锐沣色谱器件有限公司；超纯水器：millipore公司，mill-qⅱ型；高速离心机：美国sigma公司，3k15；超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司，kq-250e；万分之一天平：德国sartorius公司，bp121s；十万分之一天平：瑞士mettlertoledo公司，ax205；旋涡混合器：上海沪西分析仪器厂，xw-80a；超滤膜：天津市津腾实验设备有限公司

1.2试剂

乙腈：色谱纯，德国默克公司；甲醇：色谱纯，德国默克公司；超纯水：millipore超纯水净化系统制得；磷酸二氢钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸氢二钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠(sds)：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；β-环糊精(β-cd)：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)：美国sigma-aldrich公司；过硫酸钾：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3标准品

蝶豆素，芦丁，异槲皮苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-芸香糖苷，水仙苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚均购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度大于98.0％。

1.4样品

20批舒血宁注射液均由神威药业提供。所有样品经天津中医药大学常艳旭研究员审核确证，存放于天津中医药大学中医药研究院。

2实验条件

2.1仪器条件

所有的实验均在配有紫外检测器(waldbronn，德国)的安捷伦毛细管电泳仪上实现，仪器操作和数据分析均在安捷伦化学工作站上实现。ce分离在内径为50μm的熔融石英毛细管内进行，总长60.2cm(有效长度为52cm)(河北，锐沣)。新的毛细管应在50mbar压力下依次用1.0mnaoh、0.1mnaoh和去离子水冲10min来活化内壁。每次运行前毛细管应在50mbar压力下用0.1mnaoh冲2min，相应背景电解质溶液冲3min。每天最后一次分离之后，毛细管应该在50mbar压力下用0.1mnaoh和去离子水分别冲10min。为了保证迁移时间有良好的重复性，小瓶中的背景缓冲液应该每运行两次更换新的。

2.2实验条件

在线筛选抗氧化活性和测定抗氧化活性的毛细管电泳水相缓冲液的组成是20mm的磷酸盐，5mm的β-环糊精，40mm的十二烷基硫酸钠和7.5％的乙腈；毛细管电泳水相缓冲液的ph值为7。其中，毛细管电泳水相缓冲液中磷酸盐是通过等摩尔量的nah2po4和na2hpo4混合得到的。整个实验过程中，电压应用的是20kv，卡盒的温度控制在22℃。所有的样品进样都是在50mbar压力下进样5s。检测样品和abts⁺的波长分别是360nm和405nm。

3标准品，质控样品和样品的制备

所有的黄酮类标准品均用甲醇溶解成2mg/ml作为储备液，然后再用储备液混合并稀释成以50％甲醇为溶剂各成分浓度均为0.1mg/ml的混合标准溶液。abts和过硫酸钾分别用去离子水溶解成浓度为9mg/ml和1.516mg/ml，然后将abts和过硫酸钾溶液以1:2的比率混合，在室温下避光保存20-24h以氧化充分即得abts⁺。得到的abts⁺自由基溶液在室温避光条件下可稳定保存3-4天，用之前使用去离子水稀释到1.5mg/ml。所有的标品在用之前都保存在4℃，除了abts⁺自由基溶液外的所有溶液在使用前都用0.22μm的尼龙滤器过滤。

蝶豆素，芦丁，异槲皮苷，水仙苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-芸香糖苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚的质控样品包括低、中、高三个浓度，该质控样品是通过稀释特定浓度的混标至相应浓度得到的且最终的基质是50％甲醇。

4方法的建立

首先，优化毛细管电泳水相缓冲液的ph值和磷酸盐、β-环糊精，sds和乙腈的浓度以及电压和温度等电泳条件来检测分离舒血宁注射液中的成分和abts⁺。通过比较在线混合样品和水与样品溶液和abts⁺溶液的电泳图谱来筛选抗氧化活性成分，具有抗氧化活性的成分峰会在第二种情况下降低。通过比较abts⁺分别在线混合水和稀释后的样品得到的电泳图来确定总的抗氧化活性。实验过程中，样品和abts⁺均在50mbar压力下进样5s。

关于方法学，分别验证了该方法的精密度、线性、24h稳定性和回收率。线性是用六个点来建立的，精密度和24h稳定性是通过测定低、中、高三个浓度的质控样品来实现的(n＝6)。9个成分的回收率是通过加入等浓度的混标溶液于已知浓度的样品中来实现的。上述原始样品和加标的样品均用已优化好的条件检测，回收率用下面的公式来计算：回收率(％)＝(测得量-原有量)/加入量×100％。

5结果和讨论

5.1ph值的作用

对于迁移时间和分离度来说，毛细管电泳水相缓冲液的ph值是至关重要的，因为ph的改变会导致电解质的迁移速率和电渗流发生改变。为了确定最优的ph值，在20mm磷酸盐，5mmβ-cd，60mmsds和7.5％乙腈的条件下，优化了ph为6.5，7.0，7.5。正如图1(a)中所示，总的迁移时间随着ph从6.5升至7.5逐渐降低，而且从线的走向来看，在ph为6.5时化合物的分离度不太理想。总的迁移时间在ph7和7.5区别不大，但是对比ph7和7.5的趋势线前几个点可以看出，前几个化合物在ph为7.5的分离度并不如ph为7的好。因此，选择ph为7进行进一步的研究。

5.2缓冲盐浓度的作用

正如我们所知，缓冲盐是毛细管电泳水相缓冲液中不可缺少的一部分，因为在电压的作用下它是产生电流的物质。毛细管电泳水相缓冲液中不同浓度的缓冲盐会使样品中的成分产生不同的迁移行为，因此，缓冲盐的浓度需要优化。在此分别考察了ph7的磷酸盐10mm，20mm和30mm的浓度。图1(b)表明，随着磷酸盐浓度的增大，总的迁移时间也会延长。在10mm和30mm时，abts⁺和芦丁不能完全分开，而20mm时分离度有所改善。因此20mm是最合适的磷酸盐浓度。

5.3十二烷基硫酸钠(sds)浓度的作用

在毛细管胶束电动色谱(mekc)中，sds是一种常用的添加剂，浓度超过其cmc值就可以形成胶束，因此，为了得到好的分离度非常有必要优化sds的浓度。我们研究了不同浓度的sds(20mm，40mm和60mm)对舒血宁中的多种成分分离产生的作用。通过图1(c)，可以观察到从20mm到60mm分析时间越来越长，并且大部分峰之间的分离度也越来越大。在20mm时，图上各点的纵坐标没有太大差异，也就是说各个化合物的分离度不是很理想。然而，在60mm时水仙苷和山奈酚-7-o-葡萄糖苷的分离度较40mm时有所下降。最后，40mm被作为最优的浓度进行下一步的实验。

5.4β-环糊精(β-cd)浓度的作用

环糊精具有锥形空腔特殊结构，是一种加入到毛细管电泳水相缓冲液中可以通过改变相似分子的迁移行为从而将他们分离的物质。为了改善峰形和提高部分化合物的分离度，β-cd被加入到了毛细管电泳水相缓冲液中。固定其他条件不变，考察了0mm，5mm和10mm浓度的β-cd对舒血宁注射液中各个成分的作用。随着β-cd浓度的增加，分析时间变短并且峰形变窄。然而，通过比较图1(d)中的三条趋势线可以看出，随着β-cd浓度的增加，分离度也有所下降。考虑各种因素后，认为5mm的β-cd是分离目标化合物最好的浓度。

5.5乙腈(acn)浓度的作用

大多数的毛细管电泳水相缓冲液是水溶性的，但是相当一部分样品中的化合物在水中的溶解性并不好。acn作为一种常用的有机添加剂，加入到毛细管电泳水相缓冲液中后可以防止分析物在电泳过程中产生沉淀。acn没有紫外吸收，粘度也不高，因此不会对检测的化合物产生干扰。我们选择2.5％，5％，7.5％和10％的acn进行考察。从图1(e)中我们可以看出，在2.5％时，样品中的成分的分离度不太理想，另外，尽管随着acn浓度的增加分离度有所改善，但是分析时间也延长了。并且7.5％时峰形较好，因此，7.5％被确定为最优的条件。

5.6电压和温度的作用

除了上述提到的因素，电压和温度也会对分析物的分离度和迁移时间产生影响。电压提供了驱动力，因此，提高电压可以减少分离时间，但是过高的电压也会产生较多的焦耳热。温度主要影响毛细管电泳水相缓冲液的粘度。考察了电压(18kv，20kv和22kv)和卡盒温度(19℃，22℃和25℃)对化合物的分离的影响(分别见图1(f)图1(g))，当电压20kv和温度22℃时，分离度最好。

综上所述，最终确定的对分离检测舒血宁中各个目标化合物的最优条件是：20mm磷酸盐(ph7.5)，40mmsds，5mmβ-cd，7.5％acn，电压22kv，温度22℃。

5.7方法学验证

蝶豆素，芦丁，异槲皮苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-芸香糖苷，水仙苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚的标准曲线和线性范围均如表1中所列。lod和loq分别是通过3倍信噪比和10倍信噪比计算得来，这些化合物的lod的范围在0.3μg·ml^-1-1.8μg·ml^-1之间，loq的范围是1μg·ml^-1-6μg·ml^-1。

表1.线性方程，线性范围，lods，loqs和九个化合物的回收率(n＝6)

回收率测试结果在表1中列出，9个具有抗氧化活性化合物的平均回收率(n＝6)在96.9-104.5％之间，且rsd％值<4.49％。综上所述，该方法用来分离和定量中药注射液中的抗氧化活性成分是稳定，准确。

为了确定该建立的方法的可靠性，考察了精密度(包括日内和日间精密度)和准确度，结果如表2所示。所有化合物包括abts⁺的精密度rsd％值均在7.5％以下，准确度均在97.1-106.3％之间。结果表明，该方法可靠，准确，重复性好。

为了评价样品中的各个成分在分析过程中的稳定性，另一个需要考察的因素是24h稳定性。结果如表2所示，可以看出所有的化合物保存在4℃下24h后的三个浓度水平的保留值分别在95.9-101.7％，97.3-100.3％和99.6-100.9％范围内且abts⁺的保留值为99.6％，包括abts⁺在内的所有化合物的rsd值均小于6.48％。结果表明，样品中的目标化合物在储存和分析过程中是稳定的。

表2.日内，日间准确度和精密度，九个化合物和abts⁺(n＝6)的稳定性

5.8在线测定样品的总抗氧化活性

应用此建立的在线方法，样品的总抗氧化活性也能被测定。舒血宁注射液由于清除样自由基的能力较强，所以样品在与abts⁺在线反应之前用去离子水稀释32倍。分别用abts⁺与稀释后的样品和等量的去离子水在线反应，测定两种情况下abts⁺的峰面积(n＝3)。对比得到的电泳图谱(如图2所示)，可以看出abts⁺与稀释了的舒血宁注射液在线反应后峰面积有所降低。相对抑制率使用以下公式计算：抑制率(％)＝(p0-p1)/p0×100％)，其中，p0是abts⁺与去离子水在线混合的面积，p1是abts⁺与稀释后的舒血宁注射液在线混合后的面积。20批舒血宁注射液的总抗氧化活性抑制率结果如表3所示，结果显示舒血宁注射液有抗氧化活性，且不同批次的舒血宁注射液之间稍微有些差异。因此，该建立的在线abts⁺-ce-dad方法可以用来测定有复杂基质的中药注射液的总抗氧化活性。

表3.样品中九个化合物的含量和总的抑制率(n＝3)

5.9在线筛选样品中的抗氧化活性成分

为了筛选舒血宁注射液中的抗氧化活性成分，abts⁺(1.5mg/ml)和稀释了两倍的舒血宁注射液在50mbar压力下相继进样5s(n＝3)。通过与未和abts⁺反应的样品电泳图对比，根据峰高的降低从舒血宁样品中筛选出了九个具有抗氧化活性的成分(如图3所示)。随后，将样品电泳图与对照品的进行对比(如图4所示)可知这九个化合物分别为蝶豆素，芦丁，异槲皮苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-芸香糖苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚。通过上述结果判断可知，筛选出的这几种成分是舒血宁注射液中的主要抗氧化活性成分。

5.10样品中抗氧化活性成分的含量测定

用建立的方法分别测定20批样品中九个抗氧化活性成分的含量，结果如表3所示。从表中可以看出，蝶豆素，芦丁，异槲皮苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-芸香糖苷，水仙苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚的含量范围分别是0.0517-0.0669mg·ml^-1，0.0586-0.0767mg·ml^-1，0.0122-0.0181mg·ml^-1，0.0357-0.0578mg·ml^-1，0.0579-0.0925mg·ml^-1，0.0070-0.0103mg·ml^-1，0.0305-0.0423mg·ml^-1，0.0655-0.0869mg·ml^-1和0.0452-0.0831mg·ml^-1。20批的样品总的含量的平均值是0.453mg·ml^-1并且rsd％为7.21％，说明20批样品间有少许的差异。这个现象与上述不同批次样品间的抗氧化活性有一些差异的结果相对应。

为了评价舒血宁注射液的质量，本实验还研究了不同样品的抗氧化活性成分总含量与抗氧化活性间的关系。如图5所示，总的抗氧化活性与九个抗氧化活性成分总含量间有明显的线性关系(r＝0.9456)。结果表明，舒血宁注射液的抗氧化活性主要依赖于这些活性成分的含量，因此可以通过测定这些成分的含量来评价舒血宁注射液的质量。也就是说，本次通过选择九个抗氧化活性成分作为目标化合物来建立的在线abts⁺-ce-dad方法可以用来评价不同批次舒血宁注射液的质量。

6结论

众所周知，abts⁺是除了dpph以外的另一个经常用来测定样品抗氧化活性的氧自由基，但是用在线abts⁺-ce-dad方法来筛选抗氧化活性成分还未见报道。在本次工作中，首次将abts⁺与ce-dad仪器整合在一起建立筛选抗氧化活性化合物，其中选择舒血宁注射液作为例子来验证该建立的方法。应用该方法从舒血宁注射液中筛选出来九个抗氧化活性化合物，并成功对它们进行定量。由此可见，用该建立的在线abts⁺-ce-dad方法从具有复杂基质的中药或其制剂中筛选抗氧化活性成分并进行定量时简单、快速、准确、可靠并且环保，且可以评价不同批次的样品间抗氧化活性能力。与传统评价中药制剂质量的方法相比，该在线abts⁺-ce-dad方法结合了样品药理作用来评价其质量，并且在整个实验过程中有机试剂的消耗量都较低。总而言之，该建立的活性整合方法是一种新型的，可靠的并且强大的分析方法，不仅能筛选和定量中药及其注射液中的抗氧化活性成分，并且能对所分析样品进行质量控制。在未来的研究中，可考虑将该方法与质谱结合，用来确定天然产物中未知的活性化合物，或者与提高灵敏度的技术结合来检测筛选样品中的低含量甚至痕量化合物。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。