基于紫外光谱法测定法氏囊素主要活性成分含量的方法与流程

文档序号:12885929阅读:252来源:国知局
本发明属于分析化学领域,具体涉及基于紫外光谱法测定法氏囊素主要活性成分含量的方法。
背景技术
:法氏囊素三肽是法氏囊组织提取物(相对分子量为l000da以下)中重要的生物活性物质,能促进禽类和哺乳动物b细胞的分化发育及免疫器官的成熟,可诱导哺乳动物淋巴细胞分化,且细胞内camp和cgmp能伴随诱导过程的发生而升高。法氏囊素三肽是从法氏囊提取物中分离出来的第一个化学结构明确的生物活性因子,是一种三肽物质,其氨基酸组成顺序为lys-his-gly-nh2。由于囊素分子很小,这就决定了建立检测方法的难度和特殊性。目前常用于测定法氏囊素三肽含量的方法为:高效液相色谱、薄层色谱法和免疫组化法。这几种方法中,高效液相色谱法操作条件不易控制且较繁琐,时间过长。薄层色谱法样品用量较大,分离步骤麻烦,分离时间较长,并可能有杂质干扰。免疫组化法操作繁琐、费时,且难以在一些实验室操作。为解决这些问题,就必须改善现有的技术,寻求操作简单,准确快速可行的方法。技术实现要素:本发明目的在于针对现有技术的不足,提供一种方法简单、准确性高、易操作的基于紫外光谱法测定法氏囊素主要活性成分含量的方法。为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:基于紫外光谱法测定法氏囊素主要活性成分含量的方法,包括以下步骤:1)标准曲线的建立:以法氏囊素三肽为标准品,制备系列浓度的标准溶液,并采用紫外分光光度计测定各浓度的标准溶液在波长220-230nm处的吸光度,得到吸光度对应法氏囊三肽浓度的标准曲线回归方程;2)待测样品的制备及测定从鸡法氏囊中提取法氏囊素得到样品溶液,然后采用紫外分光光度计测定样品溶液在波长220-230nm处的吸光度,由该吸光度及上述标准曲线回归方程计算获得样品溶液中法氏囊素三肽含量。进一步,所述步骤1),标准溶液由以下系列浓度的法氏囊素三肽溶液组成:0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml。所述步骤2)中样品溶液的制备方法如下:鸡法氏囊于-20℃以下冻藏,待用时常温解冻,然后用注射用水清洗数次并去除鸡法氏囊表面筋脂,然后用绞肉机绞碎得到法氏囊组织,往法氏囊组织中加入等量的注射用水并置于组织捣碎机中搅拌匀浆,得到匀浆液,将匀浆液反复冻融5-8次使得细胞完全破裂,然后将匀浆液于2-8℃条件下,4000-6000r/min离心20-40min,取上清液;将上清液用0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤,收集微滤透过液并采用1-5kd滤膜进行切向流超滤,收集超滤透过液;将上述超滤透过液经0.1-0.22μm除菌过滤器除菌,收集的液体即为含有法氏囊素的样品溶液。进一步,所述步骤1)和步骤2)均在波长220nm或波长230nm处测定吸光度。本发明法氏囊素三肽标准品购自上海吉尔生化生物有限公司,纯度≥98%。本发明采用以上技术方案,基于紫外分光光度计定量测定蛋白质浓度原理来测定法氏囊素中主要活性成分——法氏囊素三肽的含量,法氏囊素三肽只有三个氨基酸,与大蛋白质吸收峰不同,其吸收峰波长主要在220nm和230nm处,与传统的高效液相色谱、薄层色谱法和免疫组化法相比,本发明具有简便、快速、易于操作等优点,对试验环境、仪器设备要求不高,适合一般生产企业使用。附图说明图1为本发明的标准曲线回归方程。具体实施方式实施例1标准曲线的建立由于从法氏囊组织中提取的法氏囊素含量较低,采用紫外分光光度法来测定其含量时。前期需要对测定条件进行摸索,具体如下:1、将紫外分光光度计调试到工作状态,用灭菌超纯水调零;2、将法氏囊素三肽标准品用灭菌超纯水稀释至0.1mg/ml;3、采用紫外分光光度计,在波长220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm处,分别测定浓度为0.1mg/ml法氏囊素三肽的od值,结果如表1所示。表10.1mg/ml法氏囊素三肽在不同波长处的吸光值由表1可知,0.1mg/ml的法氏囊素三肽溶液在波长270-300nm处无法测得吸光值,因此后续选择波长220-260nm处测定吸光值。4、将0.1mg/ml法氏囊素三肽溶液用灭菌超纯水倍比稀释,分别测定波长220nm、230nm、240nm、250nm、260nm处的od值,结果如表2所示。表2不同浓度法氏囊素三肽在不同波长时的吸光值5、根据表2,不同浓度法氏囊素三肽溶液主要吸收峰在220nm和230nm波长处,因此选波长220nm或230nm时的od值建立od值对浓度的回归方程,本实施例随机选定波长230nm时各浓度的法氏囊素三肽溶液对应的od值建立标准曲线回归方程。标准曲线回归方程:y=63.252x+0.6447其中,y代表法氏囊素三肽浓度,x代表od值,相关系数r2=0.9947。实施例2样品溶液的制备鸡法氏囊于-20℃以下冻藏,待用时常温解冻,然后用注射用水清洗数次并去除鸡法氏囊表面筋脂,然后用绞肉机绞碎得到法氏囊组织,往法氏囊组织中加入等量的注射用水并置于组织捣碎机中搅拌匀浆,得到匀浆液,将匀浆液反复冻融5-8次使得细胞完全破裂,然后将匀浆液于2-8℃条件下,4000-6000r/min离心20-40min,取上清液;将上清液用0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤,收集微滤透过液并采用1-5kd滤膜进行切向流超滤,收集超滤透过液;将上述超滤透过液经0.1-0.22μm除菌过滤器除菌,收集的液体即为含有法氏囊素的样品溶液。实施例3样品溶液中,法氏囊素主要活性成分含量的测定:按照实施例2的方法,制得3批样品溶液,然后采用紫外分光光度计,测定样品溶液在波长230nm处的吸光度,由该吸光度及实施例1的标准曲线回归方程计算获得样品溶液中法氏囊素三肽含量。结果如表3所示。表3法氏囊素提取液批次201700120170022017003吸光值(230nm)0.5820.5680.601法氏囊素三肽浓度(μg/ml)37.4636.5738.66本发明基于紫外光谱法来测定法氏囊素三肽的含量,与传统的高效液相色谱、薄层色谱法和免疫组化法相比,本发明方法具有简便、快速、易于操作等优点。当前第1页12
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