本发明涉及青贮玉米检测领域，尤其涉及一种青贮玉米中非结构性碳水化合物含量测定方法。
背景技术：
青贮玉米是一种重要的青贮饲料，在反刍动物饲料中占有重要地位。青贮玉米是指在玉米的乳熟期至腊熟期，将玉米茎叶或带果穗的整株玉米收获，经切碎后可直接饲喂牛、羊等反刍类动物，主要是进行贮藏发酵。发酵后的青贮玉米具有营养丰富、适口性好、转化率高、畜产品品质优良，可长期贮存等优点，不仅可为家畜提供生长发育以及生产所需的营养，也可为青绿饲料短缺的冬春季节提供饲料补充，是畜牧养殖业的主要饲草饲料。
2015年中央的一号文件指出：“要加快发展草牧业，支持青贮玉米和苜蓿等饲草料种植，开展‘粮改饲’和种养结合模式试点，促进粮食、经济作物、饲草料三元种植结构协调发展”。我国畜牧业中长期发展的战略方针是大力发展牛、羊等反刍类草食家畜的生产，其重要的基础饲料是优质粗饲料，青贮玉米作为重要的饲料来源，其需求量大大增加。所以，种植青贮玉米不仅成为了粮农的新出路，同时也顺应了时代的发展要求。
青贮玉米品种的选育尤为重要，而青贮玉米的品质则是选育青贮玉米品种的重要条件之一。青贮玉米中碳水化合物含量的多少，是评价青贮玉米品质的重要指标。碳水化合物是青贮玉米光合作用的主要产物，包括结构性碳水化合物和非结构性碳水化合物。结构性碳水化合物主要包括纤维素、半纤维素、木质素，非结构性碳水化合物主要指淀粉及可溶性糖(麦芽糖、葡萄糖等)。结构性碳水化合物的测定已有国标和行业标准方法。针对青贮玉米中非结构性碳水化合物的测定尚未见国家标准或行业标准发布；目前也尚未检索到公开发表的青贮玉米中非结构性碳水化合物含量检测的方法与技术。而青贮玉米中非结构性碳水化合物含量检测难点是大量存在的纤维素、半纤维素、木质素等物质的干扰，一般青贮玉米中纤维素、半纤维素、和木质素含量占35％～65％，用常规方法测定青贮玉米非结构性碳水化合物含量时，纤维素和半纤维素一同被水解成还原糖，严重影响非结构性碳水化合物含量测定，不能得到准确结果。
技术实现要素：
基于现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种青贮玉米中非结构性碳水化合物含量测定方法，能准确测定青贮玉米中非结构性碳水化合物的含量。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明实施方式提供一种青贮玉米中非结构性碳水化合物含量测定方法，包括：
取所检测的青贮玉米全株进行粉碎、杀青、烘干后，再次粉碎过40目筛，烘干，密闭保存，制备成待测样品；定量称取待测样品，加入氯化钠缓冲液悬浮，沸水浴10min使淀粉糊化，糊化后冷却至60℃以下，依次加入α-淀粉酶液、支链淀粉酶液和糖化酶液，分别用各酶的最适反应环境孵育水解，定容、过滤，取滤液测还原糖，根据还原糖计算得出所检测的青贮玉米的非结构性碳水化合物含量。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的青贮玉米中非结构性碳水化合物含量测定方法，其有益效果为：
通过依次加入α-淀粉酶液、支链淀粉酶液和糖化酶液，分别用各酶的最适反应环境孵育水解，利用酶催化反应专一性特点，只对非结构性碳水化合物进行彻底水解，不会破坏纤维素、半纤维素、木质素的结构，有效地排除了干扰，能准确测定青贮玉米所含的还原糖，进而准确计算得出所检测的青贮玉米的非结构性碳水化合物含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例提供的青贮玉米中非结构性碳水化合物含量测定方法流程图。
具体实施方式
下面结合本发明的具体内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供一种青贮玉米中非结构性碳水化合物含量测定方法，包括(参见图1)：
取所检测的青贮玉米全株进行粉碎、杀青、烘干后，再次粉碎过40目筛，烘干，密闭保存，制备成待测样品；定量称取待测样品，加入氯化钠缓冲液悬浮，沸水浴10min使淀粉糊化，糊化后冷却至60℃以下，依次加入α-淀粉酶液、支链淀粉酶液和糖化酶液，分别用各酶的最适反应环境孵育水解，定容、过滤，取滤液测还原糖，根据还原糖计算得出所检测的青贮玉米的非结构性碳水化合物含量。
上述方法中，根据还原糖计算得出所检测的青贮玉米的非结构性碳水化合物含量的计算公式为：
上式中：k：还原性单糖标准曲线斜率；
v1：样品溶液总体积(ml)；
m：样品重量(g)；
v2：显色用样体积(ml)；
0.9：还原性单糖转换成非结构性碳水化合物的系数；
od值：吸光度值
精确度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
上述测定方法中，向所述青贮玉米待测样品中加入氯化钠缓冲液的加入量为100ml，该氯化钠缓冲液中nacl的质量百分浓度为0.3％；
上述测定方法中，依次加入α-淀粉酶液、支链淀粉酶液和糖化酶液作为检测剂，用酶的最适反应环境孵育水解包括：
先向冷却后的青贮玉米样品糊化物中加入α-淀粉酶液，在85℃孵育40min,水解使青贮玉米淀粉糊化物液化；
然后，向青贮玉米淀粉糊化物液化液中加入支链淀粉酶液，在60℃孵育糖化酶30min，水解该液化液中的α-1,6糖苷键支链淀粉；
最后，向液化液后加入糖化酶液，在60℃孵育30min，水解液化液中的极限糊精及麦芽糖成葡萄糖。
上述测定方法中，依次加入α-淀粉酶液、支链淀粉酶液和糖化酶液作为检测剂中，
所述α-淀粉酶液的加入量为10ml，质量百分浓度为1％；
所述支链淀粉酶液的加入量为10ml，质量百分浓度为1％；
所述糖化酶液的加入量为10ml，质量百分浓度为10％。
下面对本发明实施例具体作进一步地详细描述。
如图1所示，本实施例提供一种青贮玉米中非结构性碳水化合物含量测定方法，能准确测定青贮玉米中非结构性碳水化合物的含量，包括以下步骤：
步骤1，青贮玉米全株进行粉碎、杀青、烘干；
步骤2，再次粉碎过40目筛，烘干，密闭保存，制备成待测样品；
步骤3，用氯化钠缓冲液悬浮；
步骤4，沸水浴10min，使淀粉糊化，冷却至60℃以下；
步骤5，加入α-淀粉酶液85℃孵育40min,水解使其液化；
步骤6，加入支链淀粉酶液，60℃孵育30min，水解α-1,6糖苷键支链淀粉
步骤7，加入糖化酶，60℃孵育30min，水解极限糊精及麦芽糖成葡萄糖
步骤8，定容、过滤、取滤液测还原糖；
步骤9，根据测得的还原糖，计算得到所检测的青贮玉米全株的非结构性碳水化合物含量。
实施例1
从制备好的品种1(品种名称：北农青贮368，来源：北京农学院)样品中称取3份3.00g的平行样品，记录称取重量(精确到千分之一克),加100ml0.3％氯化钠缓冲液悬浮，沸水浴加热10min，后冷却至60℃以下，加入10ml1％α-淀粉酶液，于85℃下孵育40min，冷却至室温，调节ph＝5.5，加入10ml1％支链淀粉酶于60℃下孵育30min，后冷却至室温，调节ph＝4.0，加入10ml10％糖化酶，于60℃下孵育30min，沸水浴10min，使酶失活，定容至250ml，混匀、过滤，收集滤液，将滤液稀释20倍，测定还原性单糖含量，根据公式计算出非结构性碳水化合物含量。计算公式如下：
注：k：还原性单糖标准曲线斜率；
v1：样品溶液总体积(ml)；
m：样品重量(g)；
v2：显色用样体积(ml)；
0.9：淀粉与还原性单糖的转换系数；
od值：吸光值。
精确度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
结果如下:
实施例2
从制备好的品种2(品种名称：北农青贮3740，来源：北京农学院)样品中称取3份3.00g的平行样品,记录称取重量(精确到千分之一克),加100ml0.3％氯化钠缓冲液悬浮，沸水浴加热10min，后冷却至60℃以下，加入10ml1％α-淀粉酶液，于85℃下孵育40min，冷却至室温，调节ph＝5.5，加入10ml1％支链淀粉酶于60℃下孵育30min，后冷却至室温，调节ph＝4.0，加入10ml10％糖化酶，于60℃下孵育30min，沸水浴10min，使酶失活，定容至250ml，混匀、过滤，收集滤液，将滤液稀释20倍，测定还原性单糖含量，根据公式计算出非结构性碳水化合物含量。计算公式如下：
注：k：还原性单糖标准曲线斜率；
v1：样品溶液总体积(ml)；
m：样品重量(g)；
v2：显色用样体积(ml)；
0.9：还原性单糖转换成非结构性碳水化合物的系数；
od值：吸光度值。
精确度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
结果如下：
本发明的测定方法，利用酶催化反应专一性的特点，采用多酶体系将非结构性碳水化合物彻底水解成还原糖，排除了纤维素、半纤维素和木质素等物质的干扰，回收率为99％-101％，重复性r2为0.999。由于青贮玉米中非结构性碳水化合物含量对青贮玉米新品种选育、新技术推广及基础研究是关键指标，因此，本发明的测定方法对我国畜牧业可持续发展起到了积极促进作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。