本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种荧光定量检测抗缪勒氏管激素（amh）的免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术：
抗缪勒氏管激素(anti-müllerianhormone，amh)是转化生长因子-β(tgf-β)超家族成员，是一种由2个55kdan端和2个12.5kdac端的同源二聚体组成的糖蛋白，为结合二硫键的非共价键。对于男性而言，amh激素是由睾丸支持细胞生成，始于胚胎形成，并贯穿生命始终，在胚胎发育期间，amh会引起缪勒氏管退化，形成正常的男性生殖管道。对于女性而言，amh激素是由卵泡颗粒细胞生成的，直至女性更年期，amh激素水平逐渐下降至无法检测的水平。
研究表明：amh在调控卵泡生长和发育，维持卵巢储备功能中发挥重要作用，amh水平与卵巢储备功能呈明显的正相关性。相对于传统的预测卵巢储备及卵巢反应性的方法（年龄及窦卵泡数目（afc），卵泡刺激素（fsh）和雌二醇（e2）等），检测血清amh有如下优势：（1）可更早、更灵敏低反应卵巢储备功能的改变；（2）不受垂体促性腺激素和经期的影响，在整个月经周期中数值变化不大；（3）在监测卵巢储备力、预测体外受精联合胚胎移植技术（ivf）的卵巢反应性、预防卵巢过度刺激综合症（ohss）、多囊卵巢综合症（pcos）的诊断中具体其他指标不可比拟的优势。amh是目前预测卵巢反应性、评估卵巢储备功能的最理想的生物标志物。
目前临床上amh的检测方法有酶联免疫法（elisa）、电化学发光法和化学发光法，这些方法都有各自的优点和不足。elisa法检测步骤多、耗时长，操作过程的影响因素较多，易造成假阳性和假阴性结果。因此目前逐步被化学发光法替代，但这类方法为全封闭系统，价格昂贵，需要专门培训仪器使用人员，维修及检测成本高，并且不适合单人份和小批量检测用，目前不利于amh检测在国内的广泛开展。
鉴于目前尚无快速、准确的定量检测amh的方法，本发明的目的是提供一种可用于快速定量检测amh的免疫层析试纸条，用于评估和监测女性的卵巢储备功能，所述试剂具有操作简单、方便快捷、经济、准确定量等优点，更适用于在各医疗机构广泛开展。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种操作简单、方便快捷、经济、测定准确的amh检测试纸条。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种荧光定量检测amh的免疫层析试纸条，由样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸顺次搭接在pvc底板上构成，所述的标记垫和所述的样品垫相接，所述的包被膜和所述的标记垫相接，所述的吸水纸和所述的包被膜相接；所述标记垫上喷涂有荧光微球标记的amh单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素；所述包被膜包含检测线和质控线，所述检测线包被有与所述荧光微球标记的amh单克隆抗体处于不同表位的另一种amh单克隆抗体，所述质控线包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。
优选地，所述荧光微球标记的amh单克隆抗体的浓度为0.1~1.0mg/ml，稀释比例为5%~20%。所述荧光微球标记的亲和素的浓度为0.1~1.0mg/ml，稀释比例为0.5%~5%。所述含荧光微球标记的amh单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素的标记垫处理液的喷量为3~6μl/cm。
优选地，所述荧光微球的粒径为100~500nm。所述荧光微球的激发波长为310~550nm，发射波长为340~620nm。
优选地，所述包被膜检测线上包被的amh单克隆抗体的浓度为0.5~2mg/ml，喷量0.1~0.2μl/mm。所述质控线上包被的兔抗亲和素抗体的浓度为0.5~2mg/ml，喷量0.1~0.2μl/mm。
本发明还提供一种荧光定量检测amh的免疫层析试纸条的方法，包括以下步骤：
（1）荧光微球标记蛋白的制备
取一定量的荧光微球，10000~15000rpm第一次离心5~15分钟，第一次离心分离得到的沉淀物用10~100mmph6.0~7.0磷酸盐缓冲液调节浓度为0.1%~1%，并超声分散；加入终浓度为0.1~5mg/ml的碳二亚胺（edc），混匀，再加入终浓度为0.1~5mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），混匀；室温孵育20~40分钟后10000~15000rpm第二次离心5~15分钟，第二次离心分离得到的沉淀物用10~100mmph6.0~7.0磷酸盐缓冲液溶解。将复溶后的荧光微球超声分散，按照0.1~1.0mg/ml荧光微球的比例分别加入amh单克隆抗体和亲和素，混匀后室温旋转混合反应1.5~3小时，10000~15000rpm第三次离心5~15分钟，第三次离心分离得到的沉淀物用含10~40mm乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的tris-hcl（10~40mm，ph7.0-8.0）复溶，超声分散后旋转混合反应0.5~1小时。10000~15000rpm第四次离心5~15分钟，第四次离心分离得到的沉淀物用微球保存液复溶，2~8℃保存。
（2）样品垫的预处理
将样品垫用封闭液浸泡5分钟后，置于湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24h后于2~30℃密封保存；所述封闭液含0.1~1%的tris，0.1~1%的tween20，0.1~1%的酪蛋白，0.1~2%的peg20000，0.005~0.05%的鼠抗人红细胞。
（3）标记垫的制备
将荧光微球标记的amh单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素分别按5%~20%和0.5%~5%的稀释比例用标记垫处理液喷涂在标记垫上，喷量为3~6μl/cm。所述标记垫处理液中含有0.2~2%的酪蛋白，5%~20%的蔗糖，0.1~1%的tween-20，0.1~0.5%的pvp40，0.02~0.05%的proclin300，0.01~0.05m、ph7.4的pbs缓冲液。将制备好的标记垫置于湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24h后于2~30℃密封保存。
（4）包被膜的制备
分别将另一amh单克隆抗体和兔抗亲和素用包被缓冲液调节浓度为0.5~2mg/ml，将amh单克隆抗体喷到包被膜（3）上的检测线，将兔抗亲和素抗体喷到包被膜（3）上的质控线，所述amh单克隆抗体和兔抗亲和素抗体的用量按膜包被液量均为0.1~0.2μl/mm，检测线和质控线间隔4~8mm，湿度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥24~72h后于2~30℃密封保存，备用。
在底板上顺次相互搭接地黏贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，按照切割要求切割成3~4mm宽度的试纸条。
本发明所述的amh的免疫层析试纸条的检测原理是双抗体夹心法，样本垫中的amh抗原在层析作用下与标记垫上荧光微球标记的amh抗体结合形成复合物，该复合物在层析作用下移动至包被膜的检测线，在包被膜检测线上包被有识别amh抗原另一表位的抗体，形成双抗体夹心复合物，复合物聚集在包被膜的检测线处，受到光源激发释放出相应波长的发射光，样本中抗原浓度越高，检测线发射光的强度越高，通过荧光检测系统将光信号转化为数字信号，以浓度点为横坐标，检测线信号值比质控线信号值（t/c）为纵坐标绘制标准曲线，从而可准确定量的计算出样本中amh的浓度。
本发明与现有技术相比，有如下优点：
本发明检测线和质控线采用独立的反应系统，互不干扰和影响，并采用t/c值的方式进行定标，保证了测试结果的准确度。
本发明采用荧光免疫层析法，该检测方法灵敏度高、操作简单、成本低。可检测血液样本中浓度低至0.1ng/ml的抗缪勒氏管激素，使用的检测仪无需专业操作人员，15分钟即可得到检测结果。
本发明将荧光免疫层析技术引入amh的检测中，结合荧光检测仪，实现amh的单人份定量检测，为临床使用提供了极大的便利。
附图说明
图1为本发明的荧光定量检测amh免疫层析试纸条的结构示意图；
附图标记：1、样品垫；2、标记垫；3、包被膜；4、吸水纸；5、检测线；6、质控线；7、底板。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步详细描述，应当理解为，以下实施例是为了方便本领域技术人员对本发明方案的理解，但不作为对本发明的限定。
实施例1
amh荧光免疫层析试纸条的制备：
（1）荧光微球标记蛋白的制备
取0.1ml10%荧光微球，15000rpm第一次离心15分钟，沉淀物用50mmph6.5磷酸盐缓冲液调节浓度为1%，并超声分散；加入终浓度为2mg/ml的碳二亚胺（edc），混匀，再加入终浓度为5mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），混匀；室温孵育20分钟后15000rpm第二次离心15分钟，沉淀物用50mmph6.5磷酸盐缓冲液溶解。将复溶后的荧光微球超声分散，并分两管分别加入0.2mgamh单克隆抗体和0.1mg亲和素，混匀后室温旋转混合反应2小时，15000rpm第三次离心15分钟，沉淀物用含30mm乙醇胺和0.5%酪蛋白的tris-hcl（20mm，ph8.0）复溶，超声分散后旋转混合反应1小时，15000rpm第四次离心15分钟，沉淀用微球保存液复溶，2~8℃保存。
（2）样品垫的预处理
将样品垫用封闭液浸泡5分钟后，置于湿度＜20%的50℃的烘箱，干燥12h后于20~30℃密封保存。所述封闭液含0.1%的tris，1%的tween20，0.5%的酪蛋白，1%的peg20000，0.01%的鼠抗人红细胞。
（3）标记垫的制备
将荧光微球标记的amh单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素分别按10%和1%的稀释比例用标记垫处理液喷涂在标记垫上，喷量为4μl/cm，所述标记垫处理液中含有0.5%的酪蛋白，5%的蔗糖，1%的tween-20，0.5%的pvp40，0.03%的proclin300，0.05m、ph7.4的pbs缓冲液。将制备好的标记垫置于湿度＜20%的50℃的烘箱，干燥24h后于20~30℃密封保存。
（4）包被膜的制备
分别将另一amh单克隆抗体和兔抗亲和素用包被缓冲液调节浓度为1.0mg/ml，将amh单克隆抗体喷到包被膜（3）上的检测线，将兔抗亲和素喷到包被膜（3）上的质控线（6），所述amh单克隆抗体和兔抗亲和素的用量按膜包被液量均为0.1μl/mm，检测线（5）和质控线（6）间隔4mm，湿度＜20%的50℃的烘箱，干燥72h后于20~30℃密封保存，备用。
（5）在底板上顺次相互搭接地黏贴样品垫（1）、标记垫（2）、包被膜（3）和吸水纸（4）得到试纸板，按照切割要求切割成4mm宽度的试纸条。
实施例2
荧光免疫层析定量检测血样中抗缪勒氏管激素（amh）的浓度
（1）标准曲线绘制
将amh抗原用阴性血浆配制成25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1.0ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0ng/ml，用同一批次的试剂，每个浓度点测试6次。以检测线（t带）、质控线（c带）的荧光强度比值为纵坐标，amh参考品浓度为横坐标，建立方程并拟合成标准曲线，将标曲信息用烧录软件写到id芯片中。
（2）样品的检测：
从试剂盒中取出检测条，撕开铝箔袋包装后，平放检测条，平衡5分钟，取100μl样本加入加样孔中，室温避光反应15分钟。将id芯片插入荧光检测仪，将检测卡插入荧光仪插卡口，点击“测试”，仪器通过分析软件自动计算出待测样本中amh的浓度。
（3）与深圳市亚辉龙抗缪勒氏管激素检测试剂盒（化学发光法）检测的相关性比较。
采用本发明的试纸条与亚辉龙抗缪勒氏管激素检测试剂盒对40例人血清样本进行检测，测定结果显示，在本试纸条检测范围内（0.1~25ng/ml），两种试剂的相关性r2＞0.95（y=1.042x+0.692）。
实施例3
请参照图1，一种荧光定量检测amh的免疫层析试纸条，所述的免疫层析试纸条包括有pvc底板7，所述的pcv底板7上依次设有样品垫1、标记垫2、包被膜3、吸水纸4，所述的标记垫2和所述的样品垫1相接，所述的包被膜3和所述的标记垫2相接，所述的吸水纸4和所述的包被膜3相接；所述标记垫2上喷涂有荧光微球标记的amh单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素；所述包被膜3上设有检测线5和质控线6，检测线5和质控线6间隔4~8mm，所述检测线5包被有与所述荧光微球标记的amh单克隆抗体处于不同表位的另一种amh单克隆抗体，所述质控线6包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。
目前市面上amh的检测仅有适合医院检验科用于批量检测的酶联免疫法（elisa）、化学发光（clia）、电化学发光法，还没有适合单人份、快速检测、即时出结果的检测试剂。本专利所述amh检测试剂在高灵敏检测amh的同时又能大大缩短检测时间，为临床检验及使用带来极大方便，更适合临床科室操作。