基于凝胶电泳与化学计量学检测牛乳中非乳蛋白的方法与流程

本发明属于食品安全检测技术领域，具体的说，涉及一种基于凝胶电泳与化学计量学检测牛乳中非乳蛋白的方法。

背景技术：

食品安全与人类的生活息息相关，是受到人们广泛关注的话题。其中，食品掺假是导致食品安全问题的重要方面之一。牛乳因其具有丰富的营养价值，从而广泛受到消费者的青睐。但是在经济利益驱动下，向牛乳中添加价值成本低廉的伪蛋白成为了牛乳掺伪的主要途径之一。掺假其他非牛乳蛋白的目的是提高牛乳蛋白含量，但在此过程中会引入其他结构和不同类型的蛋白，因此采用色谱、质谱及光谱技术虽可达到检测的目的，但是，由于其相对高昂的成本与对复杂专业仪器设备的要求，限制了其使用的价值。而且，在一些经济欠发达地区，因检测资源的缺乏，无法实现色谱、质谱及光谱所需的实验条件。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种成本低廉、操作简单的检测方法，具体是基于凝胶电泳(sds-page)与化学计量学检测牛乳中非乳蛋白掺假的方法。本发明方法用于牛乳中非乳蛋白的鉴伪，得到的结果稳定、快速、准确度高，具有潜在的应用推广前景。

本发明首先采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)技术，通过蛋白染色和脱色的方法，获得牛乳和不同掺假类型及比例的牛乳样品凝胶电泳图谱。然后，结合主成分分析方法，实现对牛乳中掺假伪蛋白的鉴别。本发明技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种基于凝胶电泳与化学计量学检测牛乳中非乳蛋白的方法，其首先将真实牛乳和待检测的掺假牛乳样品进行sds-page电泳，采集凝胶图谱，用凝胶分析软件计算得到每个样品图谱的相对前沿值、条带百分比及绝对的体积；然后，结合主成分分析方法，得到真实牛乳和待检测牛乳样品的全局可视化主成分得分图，通过观测此得分图，实现对待检测牛乳样品中是否掺杂非乳蛋白鉴别的目的。

本发明中，sds-page电泳时，染色剂采用0.1％w/v考马斯亮蓝r250醋酸甲醇溶液，甲醇∶醋酸∶水的体积比为30∶10∶60；脱色剂使用醋酸甲醇溶液，甲醇∶醋酸∶水的体积比为40∶10∶50；分离胶质量浓度为12％，浓缩胶质量浓度为5％。

本发明中，采用主成分分析方法时，先用image-lab软件对凝胶分析软件计算得到的每个图谱的相对前沿值、条带百分比及绝对的体积进行分析，得到数据集；再将数据集导入matlabr2013a统计分析软件，数据进行归一化后进行主成分分析。

本发明中，非乳蛋白是乳清蛋白或者植物蛋白。

本发明中，植物蛋白为大豆蛋白或者豌豆蛋白。

和现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的sds-page技术，以其独特的网状结构，从而起到分子筛的作用。在电泳过程中，蛋白质可以保证在完整状态，并根据蛋白分子量大小、形状及所带电荷使其成梯度分开。

本发明方法成本低廉、操作简单快速，结果稳定，准确度提高，在牛乳品质检测中具有潜在的应用推广前景。

附图说明

图1表示真实牛乳的sds-page图谱。

图2表示牛乳中掺入1％的大豆蛋白和豌豆蛋白sds-page图谱。

图3表示牛乳中掺入1％的乳清蛋白sds-page图谱。

图4表示牛乳中掺入10％的大豆蛋白和乳清蛋白sds-page图谱。

图5表示牛乳中掺入10％的豌豆蛋白和乳清蛋白sds-page图谱。

图6表示牛乳和掺假大豆蛋白牛乳样品的pca得分图。

图7表示牛乳和豌豆蛋白牛乳样品的pca得分图。

图8表示牛乳和乳清蛋白牛乳样品的pca得分图。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明进一步阐述。

具体实施步骤如下：

1.样品采集和制备

由山东青岛采集生鲜原乳16种。非牛乳蛋白7种，分别为2种大豆蛋白，2种豌豆蛋白，3种乳清蛋白。将液态的牛乳样品冻干，选用一种掺假牛乳为掺假底物，配置成5mg/ml的牛乳母液。10000rpm离心20min。试样分为三层，上层为牛乳脂肪，中层为可溶性蛋白，取中层进行进一步的分析。按照4种掺假比例：1％，3％，5％，10％(w/w)进行模拟掺假。实验采用三重复。

2.sds-page凝胶电泳的配置及其染色剂和脱色剂的配置

根据实验需求配置为12％的分离胶和5％的浓缩胶。配方如下：

本实验染色剂采用0.1％w/v考马斯亮蓝r250醋酸甲醇溶液(甲醇∶醋酸∶水＝30∶10∶60)，脱色剂使用醋酸甲醇溶液(甲醇∶醋酸∶水＝40∶10∶50)。

3.牛乳和掺假牛乳的sds-page电泳

(1)灌分离胶：将按上述分离胶比例配置好的溶液，缓慢灌入灌胶仪中，由两玻璃组成的槽中，向其槽中加入200μl异丙醇压平，防止气泡产生。

(2)灌浓缩胶：待分离胶凝固后，将上层异丙醇溶液倒掉，用移液枪向其中加入约2ml的浓缩胶，并插入1.5mm厚15孔道的梳子，静置，待凝固后，收胶，保持湿润的环境，4℃保存备用。

(3)样品处理：取50μl的样品，向其溶液中加入等量的2×laemmli上样缓冲液，涡旋10s至混匀。随后，按照5％(v/v)的比例加入β-巯基乙醇，95℃水浴5min，随后立即取出，冷却至室温。蛋白标记采用pm2500彩色分子量标记，其分子量范围是9-180kda。

(4)sds-page跑胶：将凝固的胶放入电泳槽中，缓慢注入1×电极缓冲液，内槽加满，小心拔出梳子。取3μl蛋白标记液和10μl的样品小心加入样品槽中，打开电源，初始分离胶的初始电压80v，约20min后待所有孔道中的样品成直线分布，将电压调至120v，样品进入分离胶，约1h，关闭电源。

(5)染色：将整块胶取下，放入已配置好的考马斯亮蓝染色液中，固定速度，摇床染色1h。

(6)脱色：将染色后的胶置于脱色剂中，摇床脱色三次，每次1h，换液三次。

(7)拍照：使用biorad凝胶成像系统拍照。

4.数据导出

采用伯乐的凝胶分析软件对所有的sds-page图像进行处理，得到相对前沿值、条带百分比及绝对的体积。以乳清蛋白1的10％(w/w)模拟掺假物(w1-4)的条带为基准，因其拥有最多的蛋白显色条带。以此样品的条带数和相对前沿为参考，若样品含有少于w1-4的条带，则将这些条带的值设置为0。整理好样品的原始数据，并用于下一步的分析。

5.主成分分析

首先，根据主成分分析方法(pca)，从而达到一种掺假乳和真实牛乳全局可视化分析。pca是一种常用于数据压缩和探索性分析的计量学方法.每一主成分是由原始变量通过线性组合构成，且彼此间不相关。pca的输出结果为得分图和载荷图，得分图可表明样品的类型及样品之间的相关性和不同性，而载荷图用于解释变量之间的关系。一般而言，通常选择主成分1和主成分2等对pca得分贡献最大的主成分作图。而载荷图可用线性、柱状图和棒状图进行呈现，其主要用来表示各个因子对主成分贡献主要程度。

从图2和图3可以看出，当牛乳中掺假植物蛋白如大豆蛋白和豌豆蛋白比例为1％，其sds-page的图谱与真实牛乳并未看出明显差异，均有6个条带。当掺假比例增加到10％，可发现掺假植物蛋白和乳清蛋白的条带与真实的牛乳具有明显的差异，掺假大豆蛋白s1的牛乳较纯牛乳多出4条明显的特殊蛋白条带，其分子量的范围分布在180-40kda之间。而掺假大豆蛋白s1的牛乳比真实的牛乳多出3条蛋白条带，因其与s1是不同的大豆蛋白类型。其次，掺假1％豌豆蛋白p1的牛乳样品与真实的牛乳蛋白条带未有明显差异，而掺假1％豌豆蛋白p1的牛乳样品较真实的牛乳多出一条分子量在60-40kda的蛋白条带。此外，掺假1％乳清蛋白的牛乳样品与纯牛乳蛋白条带并无二致，当掺假比例增加到3％时，其较对照组多出3条明显的条带，若掺假比例增加到10％时，其掺假w1和w3样品条带增至11条，而对掺假w2的样品条带数增至9条，其掺假蛋白分子量的范围分布在180-40kda之间。可见其与对照纯牛乳之间有显著差异。从而得到初步结果，采用sds-page检测掺假牛乳具有一定的价值和潜力。

因此，将sds-page和计量学手段如主成分结合使用，从而更直观和准确的反应牛乳掺假检测的情况。采用image-lab软件进行分析，得到125×11(样品×指标)的数据集。分析时将真实牛乳与7种掺假牛乳组成独立的数据集，其矩阵由56×11构成。将其导入matlabr2013a统计分析软件，数据进行归一化后采用主成分分析，其最终结果如6、7、8图所示。

从图6中可以看出，当掺假大豆蛋白为s1时，主成分1和主成分2的得分分别是44.72％和34.26％，主成分1对区分真实的牛乳和掺假的牛乳起到主要贡献作用。此外，尤其当掺假比例达到5％以上时，主成分1能够将真实和掺假大豆蛋白的样品清晰的区分开。掺假s2大豆蛋白与真实牛乳的样品呈现出相似的区分结果。其次，对真实和掺假豌豆蛋白的牛乳，主成分2能够将其分开。但对于掺假乳清蛋白的牛乳样品与真实的牛乳而言，检测限水平达到3％。当掺假水平不小于5％后，pca对掺假样与真实的牛乳之间有很好的区分效果，与sds-page图呈现的趋势，具有良好的统一性。从最终的分析结果可知，sds-page结合pca能够区分不同掺假类型及比例的掺假样与真实样。图7与图8得到了其它掺假蛋白的鉴别模型，获得了一致的效果。通过以上实例，我们将sds-page蛋白检测技术很好的与计量学技术结合使用，为建立简洁快速的测定牛乳掺假提供了数据支持和理论思路。并且，检测方法无需任何蛋白标准品，从而得到该方法具有普遍性与可推广性。

虽然本发明已将具体实例及具体分析算法一一阐述，然而其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉牛乳掺假检检测技术和计量学算法研究者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更改与润色，包括引入其他新颖的计量学算法，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。